生物材料的采集与制备.

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1 生物材料的采集与制备

2 ㈠生物材料的采集 在实验动物功能评价中，需要采集的生物样品主要是血液和尿液及组织脏器，它是反映受试物的生物学效应和物质在体内代谢情况的最为重要的途径。 1．采血 2．采尿 3．骨髓采集： 大动物骨髓采集与人相近，多采取活体穿刺，穿刺部位一般是胸骨、肋骨、髂骨、胫骨、股骨，这些部位具有造血功能。 小动物，一般处死后，取胸骨或股骨，用注射器吸取一定量的HanK’S液冲洗出。

3 4．组织标本采取和固定 ①选取原则：一般选取正常与病变组织交界处，如果眼看不到明显变化，则各试验组标本部位应均匀一致。 所选取组织应包括脏器的重要结构或全层，如肾皮质，髓质和肾盂，选取时切勿挤压，应用手术刀，少用剪。 ②大小：厚约3～5mm，大小为1.5～2cm2 ③标记：每块标本应用铅笔在纸片上标记好，纱布包扎，投入定液。 ④固定液：标本选取后应尽早浸入固定液，使组织处于生前状态。 电镜标本取活体，1分钟内须浸入固定液。

4 饱和苦咪酸75份，36%甲醛20份，冰醋酸5份，混匀后使用。特点：细胞收缩小，细胞核着色清晰，固定时间24～48h。
固定液视情况选用： a. 中性福尔马林液： 40%甲醛100ml，酸性磷酸钠4g、磷酸氢二钠6.5g，蒸馏水900ml。此固定液穿透力强，固定均匀，对于脑神经组织及某些酶均有良好的保存作用。一般固定48h。 b. Bouin固定液： 饱和苦咪酸75份，36%甲醛20份，冰醋酸5份，混匀后使用。特点：细胞收缩小，细胞核着色清晰，固定时间24～48h。 c. 戊二醛固定液： 用于固定电镜组织标本。 1液：磷酸氢二钠35.61g，配成1000ml， 2液：磷酸氢二钠27.61g，配成1000ml， 取1液40.5ml，取2液9.5ml，混匀，加2.5%戊二醛10ml，加双蒸水至100ml。

5 ㈡生物材料的处理 1．血液标本选择 ①全血：即抗凝血，主要用于Hb、RBC、WBC、DC 测定一些生化指标。
②血浆：抗凝血离心分离，除去细胞成分所得。 主要用于凝血、纤维蛋白测定和分析用一些 生化指标。 ③血清：不加抗凝剂，自然凝固后析出的澄清淡黄色 透明液体。 夏季一般在血凝后30min分离血清。 冬季应置37℃水浴促使血清析出。 血清成分接近于组织液的化学组成，适于测定机体各种生化指标，测定血清中有关物质含量比全血更能反映机体情况。

6 2．血液标本的区别 ①血浆与血清的区别 血浆：抗凝采血后立即分离，含有纤维蛋原和前凝血酶 血清：血液凝固，血清析出后分离，不含纤维蛋原和前 凝血酶。 相同检验项目：SGPT、SGOT ，总胆红素，尿素。Ca、G、肌酸激酶等。 不同检验项目：APK、P、Na、白蛋白、尿酸、血脂等（只能用血清） ②全血一般用于血细胞分析，不宜作系列化分析。 生化分析一般用血清或血浆。

7 ①EDTA—Na2 ：能较好地保存血细胞成分，可得较纯的细胞悬液。对血细胞形态影响很小，适于血细胞分析。
3．常用抗凝剂 ①EDTA—Na2 ：能较好地保存血细胞成分，可得较纯的细胞悬液。对血细胞形态影响很小，适于血细胞分析。 常配成10%水溶液，2D（烘干）可抗凝5ml血液。 ②肝素：常用Na盐或K盐，抗凝作用强，不影响细胞形态，对血液化学分析干扰少。 肝素抗凝血不宜作血细胞培养，不宜作纤维蛋白原测定，作DC时，染色性较差。作血液量元素分析时慎用。 适于电解质分析、PH、血液气体分压测定。 一般配成1%水溶液，取0.5ml于试管，37～50℃烘干，可抗凝5ml血液。 ③枸缘酸钠：常用于血沉测定及输血时抗凝剂。不适于血液化学检验。配成3.8%水溶液，0.5ml可抗凝5ml血液。 测定ESR时,1份抗凝剂+9份血液。

8 ④草酸钾：抗凝作用强。2mg可抗凝1ml血液。
适于非蛋白氮测定，不适于K、Ca测定、PCV测定，也不适于乳酸脱氢酶，酸性磷酸酶及淀粉酶测定。 配成10%水溶液，用时在55℃烘干备用。 ⑤草酸钠：同草酸钾。 ⑥草酸钾—草酸铵：可使血细胞不变形。 适于PCV及全血和血浆比重测定。不适于非蛋白氮、尿素及血氨等含氮物质测定。 配法：草酸钾0.8g，草酸铵1.2g，蒸馏水至100ml，临用时于80℃以下烘干，每1ml可抗凝10ml。 ⑦草酸锂：适于K、Na、Ca、CO2结合力，尿素氮、肌酐、肌酸、糖、纤维蛋白及血浆白蛋白，血红蛋白电泳等测定。 一般配成40%水溶液，0.1ml 可抗凝2-4ml血液。用时70℃以下烘干备用。

9 ㈢生物材料的制备 1．血浆制备： 自然分离：抗凝血置4℃冰箱，12h可使血细胞与血浆充分分离。
离心分离：抗凝血以3000rpm，5-10min. 保存：采血6h内从全血分离出的血浆在-18℃以下可保存12个月 2．血清制备： 采血后室温下自然凝固后即析出血清。 冬季，采血后37℃水浴30min，可加快凝固。 或将全血置4℃冰箱3-4h，再以1500～2000rpm 离心15’，上清液即为血清。 血液凝固后用竹签或玻璃针（钝头），沿管壁轻轻剥离血块，血清即出，然后置2000～2500rpm ,离心20min。轻轻吸出血清备用。 如上清液呈淡红色，甚至红色，表明有溶血，应废弃。 3．血细胞分离制备（见实验指导P3）

10 4．无蛋白血滤液制备 方法： ①使蛋白质脱水沉淀：常用甲醇、乙醇、丙酮等有机试剂或（NH4）2SO4、Na2SO4，NaCl等中性盐类沉淀。 ②有机酸沉淀剂：常用的有苦味酸，钼酸、磷钨酸、水杨酸及三氯醋酸等。（PH要稍低于Pr.等电点） ③重金属离子沉淀：如En++、Cd ++ 、Hg ++ 、Fe ++ 、Ca ++ 及Pb ++等。（PH要稍高于Pr.等电点） 蛋白质沉淀后，离心除去蛋白质。 具体常用方法有钨酸法，三氯乙酸法，硫酸锌—氢氧化钡法。 5．组织匀浆制备（见实验指导p4）