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High Performance Liquid Chromatography
第三章 高效液相色谱法(HPLC) High Performance Liquid Chromatography
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§3- 1 高效液相色谱法概述 一、定义 以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充色谱柱的色谱分析方法。
§3- 1 高效液相色谱法概述 一、定义 以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充色谱柱的色谱分析方法。 高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术. 二、HPLC特点 1、高压 经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法中，流动相改为高压输送（150～350 105 Pa ，最高输送压力可达450105 Pa）;
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2、高速 由于流动相流速高，分析时间大大缩短，几 min、十几min可完成一个分析任务。 HPLC色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）。 3、高效 利用高灵敏度的检测器，检测灵敏度大大提高。 紫外检测器 g 荧光检测器 g 4、高灵敏度
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高效液相色谱
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三 、液相色谱分离原理及分类 液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。 根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合相色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
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四、液相色谱与气相色谱的比较 1、相同点 （1）基本原理一致：不同组分在两相中的作用力不同。 （2）基本概念一致：
基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。 （3）基本理论一致： 塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。
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由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的有性质本质不同，因此，两种方法也有不同之处：
2、不同点 由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的有性质本质不同，因此，两种方法也有不同之处： （1）仪器设备和操作条件不同； （2）应用范围不同；
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气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析； 而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 ~ 80%。
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（3）液相色谱分离能力比气相色谱更强 因为：①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用（只能选择固定相）。 而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品组分分子，为提高选择性增加了一个因素。还可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性（能同时选择固定相和流动相） 。
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②液相色谱固定相类型多,如离子交换色谱和排阻色
谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱是不 可能的。 ③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容 易，而且回收是定量的，可以做成制备色谱。 （5）液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复 杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱 技术是互相补充的。
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综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。
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§3- 2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 （液相色谱速率理论） 与气相色谱速率理论对照自学。
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§3- 3、4、5 高效液相色谱的主要类型及分离原理
一、高效液相色谱法分类 根据分离机理的不同，HPLC可分为以下类型： 1. 1、吸附色谱（液-固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。 2、分配色谱（液-液分配色谱）：早期通过在载体上涂渍一薄层固定液制备固定相, 现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在载体表面。
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3.离子交换色谱：固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。
4.离子对色谱法：将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。
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5.离子色谱法：用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，以电导检测器检测组分含量，用抑制柱消除强电解质背景离子对电导检测器的干扰。（与离子交换色谱法不同的是分离组分的检测器不同）
6.凝胶色谱（空间排阻色谱）：以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
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二、液一液分配色谱法（LLPC） 在液-液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的、水溶性和油溶性的、离子型的和非离子型的化合物。 1．分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。
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2、固定相 (1)担体(表面多孔型) 它是30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。由于固定相仅是表面很薄一层，因此，传质速度快，加之是直径很小的均匀球体，装填容易，重现性好，现已广泛使用！ 但表面积小，柱容量低，需用高灵敏度检测器。
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由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定液选择较简单，只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。
（2）固定液 由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定液选择较简单，只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。 A 强极性固定液β，β′一氧二丙腈 B 中等极性的聚乙二醇 C 非极性的角鲨烷等。
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（4）化学键合固定相（CBPC） 为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。 它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法，它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个革命性突破。 是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。
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A 原理：利用化学反应，使硅胶表面的硅羟基与
各种固定液有机物或有机硅化合物反有 应，将固定相与载体之间形成化学键， 采用化学键合相的液相色谱称化学键合 相色 谱法。 由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。
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B 化学键合类型 + （1）硅酸酯型键合相 Si O—R HO — R O—H 150 ℃ 3～8 h （2）硅氮型键合相 Si O—H
SOCl2 Cl + H2N (CH2)nX NH (CH2)nX
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+ （3）硅 碳型键合相 + RMgX Si O—H SOCl2 Cl R （4）硅氧烷型键合相 Si O—H
X：Cl, OCH3, OC2H5 等 + R3 R1 R2 X O
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C 常见的化学键合固定相 （1）非极性键合相（反相键合相色谱法）
此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，如硅胶—C18H37（ODS，C18）、硅胶—苯基等；流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇—水、乙腈一水、水和无机盐的缓冲溶液等，由于流动相极性大于固定相极性，称反相健合相色谱法。
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A 它多用于分离多环芳烃等低极性化合物； B 采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，也可用于分离极性化合物； C 若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。 反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。 （2）极性键合相（正相键合相色谱法） 以极性的有机基团，CN、NH2、双羟基等键合在硅胶表面作为固定相；而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为流动相，分离极性化合物。此时，组分的分配比k值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。
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这种色谱方法主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。
（3）离子型键合相色谱法 以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如—SO3H、—CH2NH2、—COOH等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类同。
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3、流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度。 正相分配色谱: 适用于极性化合物的分离，其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 反相分配色谱： 适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。
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三、液一固吸附色谱法(LSAC) 液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。 1、分离原理 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，与流动相溶剂分子（S）在固定相表面发生竞争吸附: X + n S吸附= X吸附 + nS
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达平衡时，有： 其中K为吸附平衡常数，K值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。K值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。K值可通过吸附等温线数据求出。
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2、固定相 吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不同的吸附剂，如硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。等。由于硅胶的优点较多，因此，以硅胶用得最多。 目前最广泛使用的还是表面多孔型微粒填料。 它由直径为5～10 µm的吸附剂微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
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3、流动相 一般把液-固吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。
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四、离子交换色谱法（IEC） 利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。 1、离子交换原理 离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相离子交换剂交换能力的差别来实现分离的。
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固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换。
2、离子交换固定相 固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换。 Ca2+ Na+
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离子交换反应： 阳离子交换： 阴离子交换： 一般形式：
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固定相基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。
离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分（见下表）
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3、离子交换色谱流动相 离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）水的缓冲溶液。
通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。 分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低pH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。
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离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。
五、离子色谱法（IC） 离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。 1、离子交换色谱法对无机离子分离检测的困难 在普通离子交换法中，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测，因而，离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。
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为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相。 2、离子色谱法原理 以离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，利用抑制柱消除流动相强电解质对测量影响，以电导检测器检测组分信号的色谱分析方法。
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例如对于阴离子分析，色谱柱内为阴离子交换树脂，在流动相中，待测阴离子（如Br-）与阴离子交换树脂上的OH-离子交换：
洗脱过程为上述逆过程： 洗脱
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在阴离子分析中，最常见的洗脱液是NaOH ，洗脱过程中，OH-离子从分离柱的阴离子交换位置置换出待测阴离子Br-。当待测阴离子从柱中被洗脱下来进入检测器电导池时，要求能检测出洗脱液中电导的改变。但洗脱液中OH-离子的浓度要比试样中阴离子浓度大得多才能使色谱柱正常工作。因此，与洗脱液的电导值相比，由于试样离子进入洗脱液而引起的电导的改变非常小，因而，用电导检测器直接检测试样中离子的灵敏度极差。
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若在色谱柱中，设立一个抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相。
上例分析中，若使分离后的洗脱液通过填充有高容量H+型阳离子交换树脂的抑制柱，则在抑制柱将发生如下反应：
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可见，从抑制柱中流出的洗脱液中，洗脱液（NaOH）已经变成电导很小的水，消除了本底的影响；试样阴离子则转变为相应的酸，由于H+的离子趟度很大，所以，大大提高了电导检测的灵敏度。
3、离子色谱法装置 双柱型离子色谱法 色谱柱 抑制柱
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4、离子色谱法优点 （1）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析； （2）分离能力高
双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250 mm), 流动相：0.003mol·L-1 NaHCO3 / mol·L-1 Na2CO3，流量138 mL/h。 七种阴离子在20 min内基本上得到完全分离，各组分含量在3～50 ppm。 （1）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析； （2）分离能力高 在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。 （3）分离混合阴离子的最有效方法
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离子对色谱法原理 六、离子对色谱法（IPC）
离子对色谱法是离子对萃取技术与色谱法相结合的产物。在20世纪70年代中期，Schill等人首先提出离子对色谱法，后来，这种方法得到十分迅速的发展，是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。 离子对色谱法原理 离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质（分析物）离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对化合物，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。
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离子对分配机理： 阴离子分析：烷基胺类，如氢氧化四丁基铵， 对离子 氢氧化十六烷基三甲基铵； 阳离子分析：烷基磺酸类，如已烷磺酸钠；
离子对色谱的分离机理主要是离子对分配机理; 假如有一离子对色谱体系，固定相为非极性键合相，流动相为水溶液; 在流动相中加入一种电荷与待分离组分离子X+带相反的对离子Y-，则组分离子X+与对离子Y-首先形成离子对化合物X+ Y-，然后在固定相和流动相中分配：
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由于离子对化合物X+ Y-具有疏水性，因而被非极性固定相提取。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对疏水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同。这就是离子对色谱法分离的基本原理。
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平衡常数： 组分的分配系数： 因此，组分的分配系数 KX与 水相中对离子Y-的浓度和平衡常数KXY有关。
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正相离子对色谱法：极性疏水性固定相，非极性流动相；
反相离子对色谱法：这种色谱法的固定相采用非极性的疏水性化学键合固定相［如十八烷基键合相（ODS）等］，流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。 键合相反相离子对色谱法操作简便，只要改变流动相的pH值、平衡离子的浓度和种类，就可在较大范围内改变分离的选择性，能较好解决难分离混合物的分离问题。此法发展迅速，应用较广泛。
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七、凝胶色谱法（SEC） 2、凝胶色谱固定相
1、定义： 基于试样中组分分子的尺寸和形状不同来实现分离的色谱分析方法，称凝胶色谱法，又名尺寸排阻色谱法，主要用于较大分子的分离。 2、凝胶色谱固定相 按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。
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凝胶: 指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类：
（1）软性凝胶 具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶
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比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。
（2）半刚性凝胶 比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。 如高交联度的聚苯乙烯（Styragel） （3）刚性凝胶 溶胀性最差。它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离。 如多孔硅胶、多孔玻璃等。
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常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。
3、凝胶色谱流动相 A 凝胶色谱谱所选用的流动相必须能溶解样品，同时必须能溶胀凝胶。 B 流动相的粘度要小。 C 所选择的流动相还必须与检测器相匹配。 D 以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。 常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。
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凝胶色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点：
4、凝胶色谱的特点 凝胶色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点： (1)保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息； (2) 保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较 低的检测器； (3) 固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子 基本不保留分子，因此柱寿命长； (4) 不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量 差别必须大于10％才能得以分离。
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八、高效液相色谱流动相 二、常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 2、按极性可分为极性、弱极性、非极性；
一、流动相分类 1、按组成不同可分为单组分和多组分； 2、按极性可分为极性、弱极性、非极性； 二、常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
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由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。
三、对流动相溶剂的要求： 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。 （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良 好的选择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。下表列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。
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（3）纯度要高。由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。
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（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。
（5）粘度要低。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。
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§3–6 高效液相色谱仪 贮液器 高压泵 检测器 梯度洗 脱装置 色谱柱 压力表 进样器 馏分 收集器 一、仪器基本组成
§3–6 高效液相色谱仪 贮液器 高压泵 检测器 梯度洗 脱装置 色谱柱 压力表 进样器 馏分 收集器 一、仪器基本组成 五大部分：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理与输出系统。
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工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入待分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。
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二、各部分功能简介 1、高压输液系统 包括溶剂贮存器、高压输液泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。 （1）溶剂贮存器：由玻璃、不锈钢、聚四氟乙烯
塑料等制成容量1～2 L容器，用于贮存足够 数量、符合要求的流动相。 溶剂使用前要过滤和脱气 溶剂脱气方法 抽真空脱气法、吹氢脱气法 超声波脱气法 加热脱气法
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（2）高压输液泵 A 作用：将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续 不断地送入流路系统，它是HPLC的关键 部件，要求压力：150～450×105 Pa。 。 B 对高压输液泵的要求： 输出压力高:（150～500）×105 Pa； 流量范围宽: 0.1～ 10 mL/min 内连续可调； 流量恒定，无脉冲； 流量精度和重复性好（0.5%以内）； 耐腐蚀、密封性能好。
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C 高压输液泵类别 恒流泵：在一定操作条件下，输出流动相流量保 持恒定，而与色谱柱引起阻力变化无关；
恒压泵：能保持输出压力恒定，但其流量则随色 谱系统阻力而变化，故保留时间的重现 性差。 它们各有优缺点。目前恒流泵比恒压泵优越，使用较普遍 恒流泵分机械注射泵和机械往复泵两种。
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2、进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30 cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。
柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 （1）组成：进样口，注射器，进样阀等。 （2）作用：把分析样品快速、有效地送入色谱柱内。 （3）要求：为获得良好分离效果及分析重现性，需将样 品“浓缩地”瞬间注射到色谱柱顶端, 成为一个样点。
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（4）六通阀进样装置工作示意图 准备状态 进样状态 流动相入口 色谱柱入口 样品出口 样品入口 样品环
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3、分离系统——色谱柱 （3）色谱柱 （1）组成：色谱柱（包括固定相）、柱温控制箱、 连接管。 （2）作用：使被分析物质在色谱柱内分离。
标准柱型：内径 4.6mm，长度15或25 cm，柱管材料有不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。 填料颗粒度：5～10 µm 。
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（4）使用色谱柱注意事项： A 溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤， 防止堵塞。 B 更换流动相要渐变。 C 用后要清洗。 D 不用时要保存好。
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4、检测系统 （1）作用：将色谱柱流出组分进行检测，并将浓 度或质量信号转变成电信号输出。 （2）要求：A 灵敏度高； B 稳定性好；
C 线性范围宽； D 死体积小； E 对流动相流量变化不敏感。
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（3）常用的高效液相色谱检测器 A 紫外光度检测器（UV） 是HPLC中应用最广泛的检测器。它的原理基于待测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，试样浓度与吸光度的关系服从朗伯-比尔定律。 优点：灵敏度高，选择性好，对流量和温度的变化不敏感，适用于梯度淋洗，线性范围宽，适用于痕量分析。最小检测量10-9g·mL-1。
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缺点：只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，流动相选择受限制。要求流动相在测定波长下无吸收。
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B 光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。
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C 示差折光率检测器 检测器是一种通用型检测器。它的作用原理是纯流动相与包含样品的流动相之间的折射率不同，检测器把这种差值检测出来，给出信号，信号的大小与样品含量成正比。 纯流动相与待测组分的折射率相差越大，检测器灵敏度越高，灵敏度可达10-7g·cm-3。 通用性强，不破坏样品，线性范围宽。 主要缺点是灵敏度低，不适宜痕量分析，对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。
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D 荧光检测器 E 电导检测器 F 化学发光检测器
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5、高效液相色谱附属系统 它包括脱气、梯度淋洗、温控、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置 。 （1）什么是梯度洗脱？ 在流动相中，使用两种或两种以上不同性质的溶剂，使其按一定程序改变配比，从而使流动相极性、pH、离子强度相应变化，达到改变待分离样品的选择因子和保留时间，提高分离效果和分析速度的目的。 HPLC梯度淋洗与GC中的程序升温类似。
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（2）梯度洗脱分类 外梯度洗脱（低压梯度）:
通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例先混合后，再用高压输液泵压入色谱柱系统（只需一台泵）。 内梯度洗脱（高压梯度）: 两种或多种流动相分别用泵加压后，按一定比例混合，再输入色谱柱系统（需二台甚至多台泵）。
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§3–7 色谱分离方法类型的选择 一、色谱分析方法选择的依据 1、分析样品的性质：相对分子量；化学结构；极 性；溶解度等。
2、液相色谱分离类型的特点：液-固；液-液；离子 交换；离子对色谱；离子色谱等。 3、实验室具体条件。
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二、相对分子质量与色谱分析方法选择 三、液相色谱分析类别选择 一般而言： 气相色谱：相对分子质量 < 200，挥发性较高样品；
标准液相色谱（液-固；液-液；离子交换；离子对色谱；离子色谱） ：相对分子质量 200 ～2000； 空间排阻色谱：相对分子质量 > 2000。 三、液相色谱分析类别选择
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§3–8 高效液相色谱法应用示例 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析 1. 环境中有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50 cm2.5 mm(内径) 检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析
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2. 稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇线性梯度淋洗，
2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 ºC 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器
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（Preparative Liquid Chromatography）
§3–9 液相制备色谱 （Preparative Liquid Chromatography） 一、什么是制备色谱？ 采用色谱分离技术分离、获得高纯物质（色谱纯）的方法。 二、液相色谱是理想的制备色谱 1、液相色谱分离条件温和； 2、分离检测过程不破坏样品； 3、分离后产品易于回收。
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三、色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量，柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。 四、液相制备色谱的方法 例如：分离样品中的微量或痕量组分时：
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产物为两主成分之间的小组分 改变色谱条件，使色谱柱超载 分离切分，使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备
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五、制备型液相色谱 结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。 制备柱：内径20～50 mm，柱长50 cm。
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（Capillary Electrophoresis，CE）
§3–10 毛细管电泳 （Capillary Electrophoresis，CE） 一、概述 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。
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1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；
并发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定； 第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖；
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二、经典电泳分析 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。 按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；
按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳； 传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75 µm内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳。
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三、高效毛细管电泳 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了0.05 mm内径的毛细管； 二是采用了高达数千伏的电压。
毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加。 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。
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