实验六 小鼠骨髓细胞染色体的制备与C带染色

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1 实验六 小鼠骨髓细胞染色体的制备与C带染色
指导教师：唐颖 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

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1.实验目的 理解染色体标本制作的应用。 掌握滴片法制作动物细胞染色体的一般方法。 学会细胞的收集、低渗和洗涤等基本方法。 学会小鼠骨髓细胞染色体C带的制备。 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

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2. 实验原理 低渗使细胞膨胀，染色体松散；高空滴片时染色体进一步完全散开；再通过冷热处理，使细胞膜及核膜破裂，这些步骤都有利于观察到好的动物细胞染色体标本，是实验中的关键步骤。 染色体的显带是细胞学的一项重要技术，借助特殊的染料及染色程序，使染色体的一定部位呈现深浅不同的染色带纹。可用来鉴别染色体组、单个染色体以及深入认识染色体的结构与功能。 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

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染色体的C带染色 C带是显带技术中最简单的一种带型，C带为结构异染色质带的简称。C带可使着丝粒区、端粒区的异染色质及其他染色体区段的异染色质部分呈Giemsa深染，其他部分呈淡染。 C带染色前制备的染色体需经老化，造成染色体DNA的选择性降解。在酸、碱、盐的处理过程中, 由于异染色质包装比较紧密，特别是具有高度重复DNA序列的部分较少受到酸、碱、盐破坏，Giemsa染色呈深染；而常染色质区的DNA序列易受到酸、碱、盐的破坏，所以Giemsa染色呈淡染。 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

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3.实验材料、用品 仪器 光学显微镜，冰箱，恒温水浴锅。 材料 已制备好的小鼠（雌雄各半）骨髓染色体载玻片，染色缸，烧杯，镊子等。 试剂 盐酸(0．2mol/L)；5%Ba(OH)2（50℃预热）；，2×SSC溶液（60—65℃预热）：将17.53g NaCl和8.82g的柠檬酸钠溶于1000ml的蒸馏水中；Giemsa染液。 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

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4. 实验步骤 （1）滴片法制备染色体 a 选择体重20g左右的健康小鼠，在实验前2-3h，按2-4µg/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素。 b 用颈椎脱臼法处死小鼠，将其置于解剖板上，取出后肢完整的股骨（从髋关节至膝关节），然后剔除肌肉、肌腱，用生理盐水洗净。 c 剪去股骨两端，用带6号针头的注射器吸入1 ml低渗液，插入骨髓腔1/2部位，然后将股骨浸入含0.85%生理盐水的离心管内，反复冲洗骨髓细胞到刻度离心管内，直至骨髓腔呈白色为止（注意：动作要轻，否则很容易使细胞破裂，导致染色体丢失）。然后换4号针头轻轻抽打离心管内的细胞，尽可能使其分散。 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

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d 以1000r/min离心8min，弃去上清。 e 向细胞中加入5ml在37℃预热的0.075mol/L KCl低渗溶液，用吸管轻轻抽打均匀，置37℃恒温水浴锅内，低渗处理15-30min（使细胞膨胀）。 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

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4.实验步骤 （1）滴片法制备染色体 f 沿离心管壁缓慢加入1ml新配制的固定液预固定，以1000r/min离心8min，弃去上清。 g 加入新配制的固定液固定20min。离心去上清。如此反复固定2—3次， 固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量新配制的固定液 ml，将细胞团块轻轻吸打成悬液。 i 用吸管在干净、湿、冷的载玻片上滴2～3滴（不要重叠）上层细胞悬液，然后顺载玻片斜面用口轻轻吹散，在酒精灯上文火烘干（在空气干燥的地方可晾干或用吹风机吹干）。 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

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j 将玻片标本平放于支架上，细胞面朝上，每片滴加1:10 Giemsa磷酸盐缓冲液3～4滴，染色10min。 k 在自来水管下细流冲洗数秒，去掉Giemsa磷酸盐缓冲液，用小块纱布擦干玻片标本底面和四周。 l 将标本置于显微镜下观察和分析。先用低倍物镜找出分散好的分裂相视野，再换高倍物镜和油镜观察。注意标记好标本的雌雄。 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

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4. 实验步骤 (2) C带染色 将老化3-7 d的染色体标本在室温下用0.2mol/L的盐酸处理1 h。 用蒸馏水轻轻冲洗3次。 转入50℃ 5% Ba(OH)2溶液中温育12 min左右。 立即用自来水冲洗2min，再用温蒸馏水冲洗2次，使Ba(OH)2被冲洗干净。 将标本放人60-65℃ 2×SSC溶液中处理1 h。 用蒸馏水轻轻地冲洗载玻片，空气干燥。 染色：用Giemsa染液染色5-8 min。 用自来水轻轻地冲洗，空气干燥或电吹风吹干。 镜检：先用低倍物镜找出分散好、C带反差好的分裂相视野，再换高倍物镜和油镜观察，应看到C带区为深染，非C带区为浅染 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

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5.实验结果 白鼠骨髓细胞染色体显微镜下形态 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

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6. 注意事项 要掌握好低渗的时间、滴片的高度、及其热胀冷缩的步骤，可在实验中多设置几个条件作对照，以找出最为恰当的处理方法，保证染色体分开，清晰且完整。 因老化、酸、碱和盐处理过程中都要损失一些细胞，所以骨髓细胞滴片时要多滴一些细胞，各步清洗都要轻些，否则将冲掉很多细胞。 必须严格控制老化的时间和温度，否则C带区和非C带区染色后的反差较小，分辨不清。实验老化7 d过程中，骨髓细胞滴片先在4℃冰箱中放置4d，再于室温（20℃左右）下放置3 d，C带染色效果较好。 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

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7.思考题 动物细胞的染色体标本制作与植物染色体标本制作之间的差别与原因。 小鼠的Y染色体有何特征?如何区别雌雄个体? C带制备中老化、酸、碱和盐各步处理的作用是什么? 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室