真菌学及检验.

Presentation on theme: "真菌学及检验."— Presentation transcript:

1 真菌学及检验

2 目的与要求 1、掌握真菌的概念 2、掌握真菌的生物学性状。 3、了解真菌的致病性与免疫性。 4、掌握真菌的常规检查法。

3 真菌的基本性状

4 真菌（Fungus）概念: 是一类有典型的细胞核和完整细胞器，不含叶绿素，不分根、茎、叶的真核细胞型微生物。 细胞结构完整。

5 Fungus 特点 具有典型细胞结构（细胞核、细胞器、细胞壁） 细胞壁含几丁质和（或）纤维素 无根、茎、叶，不含叶绿素
以腐生或寄生方式摄取养料 能进行有性生殖和（或）无性繁殖

6 第一节 真菌的生物学地位与分类 生物学地位：真菌界 分类： 真 菌 界 粘菌门 (Myxomycota) 接合菌亚门 子囊菌亚门 担子菌亚门
第一节 真菌的生物学地位与分类 生物学地位：真菌界 分类： 粘菌门 (Myxomycota) 真 菌 界 接合菌亚门 子囊菌亚门 担子菌亚门 半知菌亚门 真菌门 (Eumycota)

7 对人类致病的真菌分为： 浅部真菌：侵犯皮肤、毛发、指甲，为慢性， 对治疗有顽固性，但影响身体较小 深部真菌：可侵犯全身内脏，严重的可引
起死亡。 　　此外有些真菌寄生于粮食、饲料、食品中 ，能产生毒素引起中毒性真菌病。

8 第二节 真菌的生物学性状 一、形态与结构 二、培养与繁殖 三、变异性与抵抗力

9 一、真菌的形态与结构 结构：比细菌复杂 大小：比细菌大几倍～几十倍
细胞壁缺乏肽聚糖，为几丁质(Chitin)（多聚N－乙酰葡萄糖组成），并含葡聚糖，甘露聚糖及蛋白质，某些酵母菌还含类脂体。 细胞内有较为典型的核结构和细胞器。

10 真 菌 单细胞真菌 多细胞真菌 菌丝 孢子 （如：酵母菌、类酵母菌） 据功能分 据是否有隔分 据形状分 (hypha) (spore)
叶状孢子 分生孢子 孢子囊孢子 无性孢子 有性孢子 （霉菌Mold ） 许多病原性真菌因生活的环境如营养、温度氧气等的改变，孢子与菌丝两种形态可以互变，这类真菌称为二相性真菌。

11 真菌孢子和细菌芽胞的区别 真菌孢子 细菌芽胞 抵抗力 不强，60-70短时间杀死 强，煮沸短时间不死 数目 一条菌丝可产生多个孢子
一个细菌体只形成一个芽孢 作用 为繁殖方式之一 不是繁殖方式 形成位置 可在细胞内外形成 只在细菌细胞内形成 形状 形态、色泽多样 圆形或椭圆形

12 二、真菌的培养 培养特性： 营养要求不高，在 沙 保（Sabouraud）培养基上， PH4～6生长良好。
浅部真菌： 22～28℃，生长缓慢，大多于1～2 周出现典型菌落。 深部感染真菌：37℃长的最好，生长较快，3～4 天即长出菌落。

13 1．酵母型菌落 为单细胞真菌的菌落，形态与一般细菌菌落相似，以出芽形式繁殖，如新型隐球菌。
2．类酵母型菌落 外观似酵母菌落，但可见伸入培养基中的假菌丝，它是由伸长的芽生孢子形成，如白色念珠菌。 3 .丝状菌落 为多细胞真菌的菌落，由许多菌丝体组成。丝状菌落呈棉絮状、绒球状、粉末状或石膏粉样，在下面和背面可显示不同颜色，这些以及菌丝、孢子的形状都是真菌的鉴别依据。

14 三、变异性与抵抗力 易变异：经多次传代或培养时间过久，其形态、菌落性状、色素及毒力等都可以发生改变。用不同的培养基和不同温度培养，其性状也可不同。

15 抵抗力 真菌对干燥、阳光、紫外线及一般化学消毒剂抵抗力较强；对热敏感，一般60℃1小时可杀死真菌菌丝和孢子。对2.5%碘酒，10%福尔马林都敏感，一般可用福尔马林薰蒸被真菌感染的房间。对抗细菌的抗生素不敏感；灰黄霉素、制霉菌素、二性霉素 克霉唑等对其有抑制作用。

16 第三节 真菌的致病性与免疫性 一、致病性 （一）病原性真菌感染 （二）条件致病性真菌感染 （三）真菌超敏反应性疾病 （四）真菌性中毒
第三节 真菌的致病性与免疫性 一、致病性 （一）病原性真菌感染 （二）条件致病性真菌感染 （三）真菌超敏反应性疾病 （四）真菌性中毒 （五）真菌与肿瘤

17 　　1.病原性真菌感染：主要是外源性感染，浅部真菌：有亲嗜表皮角质特性，侵犯皮肤、指甲及须发等组织，顽强繁殖，发生机械刺激损害，同时产生酶及酸等代谢产物，引起炎症反应和细胞病变。
深部真菌：可侵犯皮下，内脏及脑膜等处，引起慢性肉芽肿及坏死。　　　 2.条件致病性真菌感染 主要是内源性感染（如白色念珠菌），此类感染与机体抵抗力，免疫力降低及菌落失调有关，常发生于长期应用抗生素、激素、免疫抑制剂、化疗和放疗的患者。

18 　3．真菌变态反应性疾病 由真菌性过敏原（如孢子抗原）引起过敏症，如哮喘，变态反应性肺泡炎和癣菌疹等。 4．真菌毒素中毒症： 侵犯害肝、肾、脑、中枢神经系统及造血组织。如黄曲霉毒素、某些镰刀菌素和黑葡萄穗素。 5、真菌毒素与肿瘤 如：黄曲霉素诱发肝癌。

19 2．特异性免疫：真菌感染中细胞免疫是机体排菌杀菌及复原的关键。
二、免疫性　 1．非特异性免疫：人类对真菌感染有天然免疫力。皮肤分泌短链脂肪酸和乳酸、血液中转铁蛋白、中性粒细胞和单核巨噬细胞的吞噬作用，以及正常菌群的拮抗作用。 2．特异性免疫：真菌感染中细胞免疫是机体排菌杀菌及复原的关键。 由于皮肤癣真菌与腐生性真菌间有共同抗原，因此一般不做血清学检查Ab辅助诊断此类真菌感染。

20 第四节　真菌的常规检验法 实验室检查： 标本采集 分离培养 直接镜检 生化反应 染色镜检 免疫学试验 以直接镜检和分离培养最重要。

21 一、临床标本的采集 1．皮肤的角质性物质：毛发、指(趾)甲、皮 屑等。 2．各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳 垢、痰、粪便、尿液等。
3．血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊 液、淋巴穿刺液等。 4．脓汁及渗出物。

22 采集标本注意事项 1.采集的标本要适宜 不同真菌感染 应采取不同的临床标本。浅部真菌感染如体癣，应刮取病变边缘的痂、皮屑，发癣应取病发。深部真菌感染应取血液、脑脊液、脓汁等。 2.在用药前采集标本 一般真菌标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。

23 3.采集的标本量要足 血液和脑脊液标本5ml，胸腔液20ml，皮屑标本两块，活体组织两份 (一份送病理科检查，一份作镜检和培养)。
4. 严格无菌操作 并进行消毒处理，尤其是采集血液和脑脊液标本，要避免污染杂菌。 5. 采集标本立即送检 深部真菌标本最长不得超过2h。

24 二、检验程序

25 三、检验方法 （一）标本直接检查 不染色标本检查 染色标本检查 （二）培养检查 （三）鉴定

26 （一）标本直接检查 1. 不染色标本的直接镜检： 1）标本制备： 2）检查方法： 3）封固液：
直接采取标本制片、显微镜下直接观察，若发现真菌菌丝或孢子存在时，即可初步判定为真菌感染。 1）标本制备： 2）检查方法： 3）封固液：

27 ①KOH溶液： ②墨汁： ③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液： ④生理盐水： 本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。
主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等） ③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液： 此液透明力较强，只限于不透明的标本。 ④生理盐水： 为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。

28 直接镜检的意义 直接镜检的局限性： ①有诊断意义，如浅部真菌病等；
②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等； 直接镜检的局限性： ①阴性结果不能排除真菌感染； ②有假阳性结果。 因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。

29 2.染色标本检查 （1）革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。 （2）乳酸酚棉蓝染色 （3）糖原染色：
又称过碘Schiff（简称PAS或PASH）。真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。过碘酸使糖氧化成醛，再与品红－亚硫酸结合，成为红色，故菌体均染成红色。为真菌染色最常用的方法之一。

30 （4）嗜银染色（GMS）：染成黑色。 （5）粘蛋白卡红染色法（MCS）： 主要用于新生隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。 （6）荧光染色： 主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。

31 （二）培养检查法 1、培养基 常用真菌培养基及用途 培 养 基 用 途 沙保培养基 真菌的常规培养 放线菌酮－氯霉素琼脂 同上
　用 途 　沙保培养基　　　　　　 真菌的常规培养 放线菌酮－氯霉素琼脂　　 同上 玉米粉聚山梨酯－80琼脂 观察白假丝酵母菌的厚膜孢子 马铃薯葡萄糖琼脂　 观察真菌菌落色素，用于鉴别 尿素琼脂　　　　　　　　 用生化反应鉴别真菌 （红色癣菌和石膏样癣菌） 心脑浸液葡萄糖血琼脂　　 深部真菌培养（二相性真菌）

32 （2）试管培养：多用于菌种传代接种与保存。 （3）大培养：用平皿或培养瓶培养。 （4）小培养 可观察结构特征及发育的全过程。
2、培养方法 接种工具为接种钩、接种针和接种环 （1）直接培养 （2）试管培养：多用于菌种传代接种与保存。 （3）大培养：用平皿或培养瓶培养。 （4）小培养 可观察结构特征及发育的全过程。 1） 玻片培养 2）郭可大钢圈小培养法： 材料：培养基、钢环（用铁环或废电线之铝丝制成）、载玻片、盖玻片、毛细管、石蜡等。

33 先将无菌钢圈以热石蜡固定在玻片和盖玻片之间，钢环开口处深入底部加入培养基。加够半环即可凝固。用接种针取少量材料，接种在培养基表面。 　　
将接种好的玻片，放在平皿内，并放湿纱布以防干燥。逐日镜 检，一般约7ｄ即可长好。根据菌丝和孢子的结构特点进行真菌类别的鉴定。 真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。培养真菌的温度为28℃，但深部真菌为37℃。菌落是鉴别真菌的方法。

34 （三）真菌的鉴定 方法： 1、生化反应 2、芽管形成 3、厚膜孢子生成 4、免疫学及分子生物学试验等。

35 1.真菌的生化反应 用于主要深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。 1）糖(醇)类发酵试验 37℃，观察糖发酵情况。
2）同化碳源试验 含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基(45℃)混合，然后在培养基上分别加糖，置25℃孵育观察结果。若24h后无变化可重复加糖。如能同化则在糖周围有生长圈，否则无生长。一般对双糖发酵的真菌能同化或利用糖类或碳源。主要用于酵母菌的鉴定。

36 5）尿素分解试验 石膏样癣菌、新生隐球菌等可分解尿素。
3）同化氮源试验 同化碳源试验相同，但 需用无氮源的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。用于观察酵母菌对硝酸钾的利用情况。 4）明胶液化试验：某些真菌可液化明胶。 5）尿素分解试验 石膏样癣菌、新生隐球菌等可分解尿素。 6）测定淀粉样化合物：某些真菌可产生淀粉样化合物，遇碘后变成兰色。 7）牛乳分解试验；真菌可使牛乳酸化、凝固、胨化、碱化等

37 2.核酸检测 医学真菌的鉴定手段引入了分子生物学的鉴定方法，从核酸碱基G+Cmol％分析、限制性片段长度多态性(RFLP)Southern印迹分析到脉冲场凝胶电泳(PFGE)PCR指纹、随机扩增多态性DNA(RAPD)以及DNA特殊片段测序等。

38 单细胞真菌 （酵母菌） 多细胞真菌

39

40 真菌菌丝的形态

41 1叶状孢子 真 菌 无 性 孢 子 形 态 芽生孢子 厚膜孢子 关节孢子 2分生孢子 小分生孢子 大分生孢子

42 芽生孢子

43 Candida albicans -- chlamydospore formation on cornmeal agar假丝酵母菌 厚膜孢子

44 3、孢子囊孢子

45 孢子囊孢子

46

47

48 真菌的有性孢子 （根霉菌的接合孢子）

49 假丝酵母菌菌落

50

51

52 青 霉 菌

53 石膏样癣菌

54

55

56

57

58

59 新 型 隐 球 菌

60

61 嗜银染色（GMS）