大肠菌群计数.

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1 大肠菌群计数

2 大肠菌群的定义 指一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌群主要来源于人畜粪便, 作为粪便污染指标评价食品的卫生状况, 推断食品中肠道致病菌污染的可能。 大肠菌群不是细菌学上分类命名，而是一组与粪便污染有关的细菌。这群细菌包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌。 生化特征及血清学反应并非完全一致。

3 分布： 广泛分布于自然环境。 来源于人和温血动物的粪便。 卫生学意义 大肠菌群作为粪便污染的指标菌评价样品中是否受到粪便的污染。 大肠菌群计数的高低，直接反映了样品受粪便污染的程度。 表示对人体健康是否具有潜在的危险性。

4 大肠菌群是理想的粪便污染的指标菌 是人类和温血动物肠道菌群，在数量上占优势。 随粪便排出体外后，在外界环境影响下，其存活时间应与肠道致病菌大致相似或稍长。 检验方法简便，易于检出与计数。 对消毒剂的抵抗力应不低于肠道致病菌。

5 主要修改内容 将原标准拆分为大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌计数三个独立的标准方法，标准名称变化。
大肠菌群的MPN法中乳糖胆盐等培养基改为月桂基硫酸盐胰蛋白眎(LST)肉汤为主的培养基； 增加了对样品匀液的pH范围要求； 增加了大肠菌群的平板计数法和纸片检测法； MPN法的结果报告由原“每100g（mL）大肠菌群的MPN值”，修改为“每1 g（mL）大肠菌群的MPN值”；

6 大肠菌群计数 第一法：MPN法 第二法：平板计数法 第三法：Petrifilm测试片法

7 第一法 大肠菌群检验MPN法

8 培养基改变情况 原标准 乳糖胆盐发酵管 EMB琼脂 乳糖发酵管 新标准 第一法： 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）
煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 第二法： 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)

9 操作步骤的改变 原标准 现标准 初发酵 LST初发酵 EMB分离培养 BGLB验证 染色，复发酵 报 告 报 告

10 大肠菌群检验程图(新国标MPN法) 检样 稀释 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）36±１℃，24~48±2h 不产气 产气
煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 36±１℃，24~48±2h 产气 不产气 大肠菌群阳性 大肠菌群阴性 报告

11 样品的处理和稀释 固体和半固体食品：以无菌操作取25g）样品,放入装有225 mL生理盐水的无菌均质杯内,于8000 r/min均质1min～2min,制成1:10样品匀液，或放入225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。 液体食品：以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)中,以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:10的样品匀液。

12 根据对样品污染情况的估计,按上述操作，依次制成系列十倍系列样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时要进行调节，如有些果汁pH值很低，如果不进行调节，检验结果的误差可能就会比较大。

13 第一步：初发酵 选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液，液体样品可以包括未经稀释的原液，每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过1mL，则用双料LST肉汤）。 36℃±1℃培养24h±2h，检查倒管内是否有气泡产生或轻摇试管时是否有密集连续的细小气泡从管底逸出，如未产气则继续培养至48h±2h。

14 记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性；对产气者，则进行复发酵试验。

15 第二步：复发酵 用接种环从所有48h±2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中，置36℃±1℃温箱内，培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

16 月桂基磺酸盐胰蛋白胨（LST） 月桂基磺酸钠能抑制革兰氏阳性菌的生长，同时比胆盐的选择性和稳定性好。由于胆盐与酸产生沉淀，沉淀有时候会使对产气情况的观察变得有些困难； 乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大肠菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群和肠道致病菌； 胰蛋白胨提供基本的营养成分； LST肉汤是国际上通用的培养基，与乳糖胆盐肉汤的作用和意义相同，但具有更多的优越性。 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 ，又叫十二脘基磺酸盐胰蛋白胨肉汤，英文缩写LST肉汤。 LST肉汤 是国际上通用的培养基。与乳糖胆盐肉汤的作用和意义相同，但具有更多的优越性，LST中的选择性抑菌剂是月桂基硫酸盐，相对于胆盐稳定性更好些。 还有就是LST更容易观察。

17 发酵试验判定原则：产气为阳性。 检测步骤减少（不必分离培养），检测时间缩短24h。 注：如接种量超过1mL，则应用双料LST肉汤

18 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 胆盐可抑制革兰氏阳性菌。 煌绿是抑菌抗腐剂，可增强对革兰氏阳性菌的抑制作用。
乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大肠菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群和肠道致病菌。 发酵试验判定原则：产气为阳性。由于配方里有胆盐，胆盐遇到大肠菌群分解乳糖所产生的酸形成胆酸沉淀，培养基可由原来的绿色变为黄色，同时可看到管底通常有沉淀。

19 结果报告 根据大肠菌群阳性管数, 查MPN检索表，报告每 g (mL)样品中大肠菌群的MPN值。

20 MPN检索表的应用 MPN（最可能数）是表示样品中活菌密度的估测。因此MPN值只是活菌密度的估算值，并不是样品中活菌数的真值。

21 1g(mL)检样中最大可能数（MPN）表 -- 420 >1100 3 94 8.7 27 2 1 4,100 180 1100 42
4.5 20 2,000 90 460 3.7 15 1,000 240 290 3.6 14 430 40 210 38 1.4 9.2 37 150 16 18 93 160 11 120 200 17 75 1.3 7.4 9 43 64 7.2 110 0.17 4.6 23 9.4 36 1.2 6.2 29 6.1 35 0.15 3.0 28 9.6 21 9.5 <3.0 高 低 0.001 0.01 0.10 95%置信区间 MPN 阳性管数

22 使用MPN检索表的注意点 这个MPN检索表是ISO、FDA、AOAC、USDA/FSIS、北欧等标准通用的。 表里的数字是有小数点的。
报告单位不同。现报告单位为g/ml，而原报告单位是100g/ml。 原标准MPN表有64个组合，而现标准MPN表只有40个组合。

23 当实验结果在MPN表中无法查找到MPN值时，如：阳性管数为122，123，232，233等时，建议增加稀释度(可做4~5个稀释度)，使样品的最高稀释度能达到获得阴性终点，然后再遵循相关的规则进行查找，最终确定MPN值。

24 第二法 平板计数法 ★ ★ ★

25 适用范围与培养基 平板计数法相对于MPN法来说，检验结果更精确。
所用培养基：VRBA琼脂、BGLB培养基。

26 选择2~3个适宜稀释度的样液，接种VRBA平板
平板计数法的检验程序 检样25g(ml)+225ml稀释液，均质 10倍系列稀释 选择2~3个适宜稀释度的样液，接种VRBA平板 36℃±1℃ 18~24h 注：VRBA(结晶紫中性红胆盐琼脂)又称为：VRB或VRBL 计数典型和可疑菌落 BGLB肉汤证实试验 36℃±1℃ 18~24h 报告结果

27 操作要点 样品稀释同第一法。 选取适宜的2~3个连续稀释度, 每个稀释度接种两个灭菌平皿, 每皿1mL。另取1mL生理盐水做个空白对照。将冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL~4 mLVRBA覆盖平板表层。

28 平板菌落数的选择 选择菌落数在30~150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。

29 证实试验 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，进行证实试验。

30 结果报告 经最后证实为大肠菌群阳性的BGLB管的百分比乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g (mL)样品中大肠菌群数 。
例：10-4样品稀释液1ml在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取10个接种BGLB肉汤，证实6个为阳性。则样品大肠菌群数为： 100×6/10×10-4/g(mL)=6.0×105cfu/g(mL)

31 什么样的菌落必须要做证实试验? 一是非典型菌落，如在颜色、直径与典型菌落不符合的菌落。
另一种情况是被检样品中含有乳糖以外的其他糖类，如牛奶、饮料等样品。本来大肠菌群的定义是发酵乳糖，但由于样品含有的其他糖类混入了培养基，使得不能分解乳糖但能分解其他糖类的细菌也能够长出红色菌落，所以需要进行证实实验。

32 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA) VRBA的主要成分：乳糖、胆盐、结晶紫、中性红及细菌生长所必需的营养成分如:蛋白胨、酵母膏等。
大肠菌群分解乳糖所产生的酸与胆盐结合，可形成沉淀。

33 第三法 大肠菌群PetrifilmTM测试片法

34 大肠菌群PetrifilmTM 测试片法原理
PetrifilmTM大肠菌群测试片是一种预先制备好的培养基系统，含有VRB 培养基，冷水可溶性凝胶和TTC指示剂，可增强菌落计数效果。表面覆盖的胶膜，可截留发酵乳糖的大肠菌群产生的气体。培养结束后计数红点周围有气泡的菌落为大肠菌群数。

35 大肠菌群PetrifilmTM 测试片检验程序
检样25g(ml)+225ml稀释液，均质 10倍系列稀释 选择2~3个适宜稀释度的样液， 接种PetrifilmTM大肠菌群测试纸片 36℃±1℃ 24±2h 计数红色带气泡菌落 报告结果

36 操作要点 按第一法的样品制备方法进行。 样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，pH值过低或过高时分别用1M NaOH或1M HCl予以调节。 合理稀释度的选择，每稀释度接种2张测试片。 接种时避免气泡产生。 培养基未凝固时勿挪动。 将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20片。

37 避免人为产生的气泡 测试片上层膜缓慢落下； 吸取样品时避免泡沫吸入； 测试片未凝固时勿挪动；
如果产生人为气泡，要作好标记，这样才能在判读时和菌落产生气泡区分开。另外人为气泡一般为不规则状。

38 结果判读 大肠菌群为红点带气泡的菌落； 圆形边缘上及边缘外的菌落不计数； 注意菌落浓度高的几种情况。

39 结果报告 选取菌落数在15~150之间的测试片作为计数标准。 选择菌落数在15~150之间的稀释度，平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15, 则计数稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以(<)1乘以最低稀释倍数报告之。 如果最高稀释度的菌落数大于150个时，计数最高稀释度的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 计数菌落数大于150个的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20即为测试片上估算的菌落数 (圆形生长面积为20 cm2)。 最终结果以“cfu/g (mL)”表示。

40 谢谢!