Lab work on Microbiology

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1 Lab work on Microbiology
微生物学实验 Lab work on Microbiology 实验指导教师：涂璇

2 实验室规章制度及实验基本要求 1.遵守实验室规则，爱护实验仪器设备。
2.实验前要写预习报告，了解目的、原理和基本方法，做到心中有数、思路清晰。 3.进入实验室要签名，指导老师检查预习报告。 4.实验操作要细心谨慎，严格遵守操作规则，认真进行观察，做好实验记录。 5.以实事求是的态度认真完成实验报告，并交给指导教师批阅。 6.随时注意实验台面的清洁，做完实验要清理好实验台面，卫生值日生要做好当日的清洁卫生。 7. 指导老师检查实验记录和实验任务，检查通过签字后方可离开实验室，走时注意关闭灯、电、火、窗。

3 实验考核 1. 微生物学实验成绩包括实验过程表现成绩、实验报告成绩
1. 微生物学实验成绩包括实验过程表现成绩、实验报告成绩 2. 实验过程表现成绩包括：实验操作是否正确规范、学习态度是否认真、实验结果如何是否符合逻辑、清扫值日等方面。成绩分为 ：良好、一般、差三级，相当于百分制 85、75、55。 3. 实验报告成绩包括：实验报告的格式是否正确、原理是否论述清楚，实验结果分析讨论是否正确，报告字迹是否清楚等方面，实验报告给定成绩分为：A+、 A、 A-、 B+、B、B-、C+、C、C- 九级，相当于百份制的 95、90、85、80、75、70、65、60、55。

4 微生物实验进程表 实验一 普通光学显微镜的使用及细菌染色 实验二 实验室环境、人体表面微生物检查及常用器皿包扎
实验三 细菌的芽孢和荚膜染色及观察 实验四 培养基的制备、分装与灭菌 实验五 放线菌、霉菌形态观察 实验六 微生物分离纯化技术 实验七 酵母菌形态观察及死活细胞鉴别和显微镜直接计数 实验八 平板菌落计数与接种 实验九 土壤微生物分离纯化 实验十 环境因素对微生物生长的影响 实验十一 微生物生理生化实验 实验十二 水中细菌总数和总大肠菌群的测定

5 显微镜实验室规则及要求 实验前要预习，写好预习报告。 保持室内整洁，不要随意走动。 如若发生意外，及时报告老师。
作好实验记录，写好实验报告。 对于实验材料，写好姓名组号。 牢记无菌概念，保持清洁卫生。 上课认真听讲，课后积极讨论。 上课不许闲聊，不得随意走动。 注意实验安全，祝你实验顺利。 5

6 实验一、显微镜的使用以及 细菌简单染色和革兰氏染色
普通光学显微镜的使用 细菌简单染色和革兰氏染色

7 1 普通光学显微镜的使用 1.1 目的要求 学习并掌握油镜的原理和使用方法 1.2 实验材料 显微镜 擦镜纸 香柏油 标本

8 1.3 原理 1 主要光学显微镜种类 显微镜是由一个透镜或几个透镜的组合构成的一种光学仪器，是人类进入原子时代的标志。主要用于放大微小物体成为人的肉眼所能看到的仪器。显微镜分光学显微镜和电子显微镜。现在的光学显微镜可把物体放大1600倍，分辨的最小极限达0.1微米。 目前光学显微镜的种类很多，主要有明视野显微镜（普通光学显微镜）、暗视野显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、激光共聚扫描显微镜、偏光显微镜、微分干涉差显微镜、倒置显微镜。 电子显微镜有着比光学显微镜高得多的对物体的放大及分辨本领，它将电子流作为一种新的光源，使物体成像。目前电子显微镜包括：透射电镜，扫描电镜，分析电镜，超高压电镜等

9 明视野显微镜（brightfield microscope） 是最通用的一种光学显微镜。利用光线照明，标本中各点依其光吸收的不同在明亮的背景中成像。它由物镜、目镜、聚光镜、光源、载物台和支架等部件组成。其中聚光镜用于调节显微镜的照明，物镜和目镜是放大微小物体成像的主要部件。由同轴的两个正透镜——物镜和目镜组成的显微镜称为复式显微镜。 明视野显微镜（brightfield microscope） 是最通用的一种光学显微镜。利用光线照明，标本中各点依其光吸收的不同在明亮的背景中成像。它由物镜、目镜、聚光镜、光源、载物台和支架等部件组成。其中聚光镜用于调节显微镜的照明，物镜和目镜是放大微小物体成像的主要部件。由同轴的两个正透镜——物镜和目镜组成的显微镜称为复式显微镜。其成像原理如图所示。图中F1与F1'分别为物镜的两个焦点，F2与F2'分别为目镜的两个焦点。物件AB置于F1的前方，经物镜后，形成一个倒立的实像A'B'，A'B'所在面为中间像平面，在F2稍靠后一些。A'B'经目镜后形成放大的虚像A"B"。A"B"对物件AB是倒立的，对中间像A'B'是正立的，A"B"再通过眼睛后在视网膜上成像。　未经染色处理的生物标本，由于对光线的吸收很少，造成反差低的影像，不利于明视野显微镜观察。使用染料对生物标本染色后增加了反差，成为明视野显微镜的主要观察对象。 明视野显微镜

10 暗视野显微镜的聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。暗视野显微镜虽然不具备观察物体内部的细微结构的功能,但可以分辨0.004μm以上的微粒的存在和运动，比普通光学显微镜高50倍。因而常用于观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。 暗视野显微镜 - 基本原理 暗视野照明方式 暗视野显微镜的基本原理是丁达尔效应。当一束光线透过黑暗的房间,从垂直于入射光的方向可以观察到空气里出现的一条光亮的灰尘“通路”,这种现象即丁达尔效应。暗视野显微镜在普通的光学显微镜上换装暗视野聚光镜后,由于该聚光器内部抛物面结构的遮挡,照射在待检物体表面的光线不能直接进入物镜和目镜,仅散射光能通过,因而视野是黑暗的。暗视野显微镜由于不将透明光射入直接观察系统，无物体时，视野暗黑，不可能观察到任何物体；当有物体时，以物体衍射回的光与散射光等在暗的背景中明亮可见。在暗视野观察物体，照明光大部分被折回，由于物体(标本)所在的位置结构，厚度不同，光的散射性，折光等都有很大的变化。 暗视野显微镜 - 结构与改装 暗视野显微镜基本结构是将普通显微镜光学组加上挡光片。普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的，支架的口径适于安装暗视野聚光器，即可改装成暗视野显微镜。在无暗视野聚光器时，可用厚黑纸片制作一个中央遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方的滤光片框上，也能得到暗视野效果。挡光片是用來挡住光源中间的光线，让光线只能从周围射入标本，大小约和光圈大小相同。不同倍率用不同的光圈，所以要制作不同的挡光片。 暗视野显微镜 - 使用方法 暗视野显微镜的基本使用方法如下：  1．安装暗视野聚光器(或用厚实的黑纸片制成遮光板,放在普通显微镜的聚光器下方,也能得到暗视野效果)。  2．选用强光源,一般用显微镜灯照明,以防止直射光线进入物镜。  3．在聚光器和玻片之间加一滴香柏油,避免照明光线于聚光镜上进行全反射,达不到被检物体,而得不到暗视野照明。 4．进行中心调节,即水平移动聚光器,使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。升降聚光器,将聚光镜的焦点(图2中圆锥光束的顶点)对准待检物。  5．选用与聚光器相应的物镜,调节焦距,按普通显微镜的方法操作。 暗视野显微镜

11 相差显微镜是荷兰科学家Zernike于1935年发明的，用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化(振幅差)，这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的区别是:用环状光阑代替可变光阑， 用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。 理论基础 　　相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位指在某一时间上，光的波动所达到的位置。一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差太小，肉眼很难分辨，只有在变相差为振幅差（明暗差）之后才能被区分。相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差（即光程之差）。而相差显微镜就是利用被检物的光程之差进行镜检的。  相差显微镜的光路图 编辑本段与普通显微镜差别 　　相差显微镜有四个特殊结构：相差物镜、具有环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色的滤光片。绿色滤光片作用是：缩小照明光线波长范围，减少由于照明光线的波长不同引起的相位变化。 编辑本段用途 　　观察未经染色的标本和活细胞。 编辑本段相差显微镜的基本原理是 　　利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅（光强度）的差别，经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测的显微镜。主要用于观察活细胞或不染色的组织切片，有时也可用于观察缺少反差的染色样品。 　　把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜4个特殊之处： 　　1.环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 　　2.相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种： 　　（1）A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。 　　（2）B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。 　　3.合轴调节望远镜：用于调节环状光阑的像与相板共轭面完全吻合 相差显微镜

12 荧光显微镜(Fluorescence microscope) ： 荧光显微镜是以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区  荧光显微镜 别： 　　1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上； 　　2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 　　3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人眼。 　　荧光显微镜也是光学显微镜的一种，主要的区别是二者的激发波长不同。由此决定了荧光显微镜与普通光学显微镜结构和使用方法上的不同。 　　荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。 工作原理 光源 　　现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。 　　超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。 　　新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一些时间后，则需要高压启动（约为15000V），启动后，维持工作电压一般为50～60V，工作电流约4A左右。200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。 　　超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在灯室上有调节灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。 　　国产超高压汞灯GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的进口灯泡，平均寿命在200h以上，价格也比较低。 　　我国研制的一种简易轻便型高色温溴钨荧光光源装置，体积小，重量轻，功率小，交、直流两用（自带直流电源），易于携带，使用方便，已推广应用。滤色系统 　　滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤板型号，各厂家名称常不统一。滤板一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是蓝色的第一个字母，G是玻璃的第一个字母；我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于BG12的蓝色滤板名为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个字母，B是玻璃拼音的第一个字母。不过有的滤板也可以透光分界滤长命名，如K530，就是表示压制滤长530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有的厂家的滤板完全以数字命名，如美国Corning厂的NO：5-58，即相当于BG12。 　　1．激发滤板 根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板，提供一定波长范围的激发光。 　　紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。 　　紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300～450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。 　　紫蓝光激发滤板：它可使350～490nm的光通过。常用型号为QB24（BG12）。 　　最大吸收峰在500nm以上者的荧光素（如罗达明色素）可用蓝绿滤板（如B-7）激发。 　　近年开始采用金属膜干涉滤板，由于针对性强，波长适当，因而激发效果比较玻璃滤更好。如西德Leitz厂的FITC专用KP490滤板和罗达明的S546绿色滤板，均远比玻璃滤板效果好。 　　激发滤板分薄厚两种，一般暗视野选用薄滤板，亮视野荧光显微镜可选用厚一些。基本要求是以获得最明亮的荧光和最好的背景为准。 　　2．压制滤板 压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应波长范围的荧光。与激发滤板相对应，常用以下3种压制滤板： 　　紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫外光通过。能与UG-1或UG-5组合。常用GG-3K430或GG-6K460。 　　紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上波长的光（绿到红），能与BG-12组合。通常用OG-4K510或OG-1K530。 　　紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的光（蓝到红），可与BG-3组合，常用OG-11K470AK 490，K510。反光镜 　　反光镜的反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少，反射达90%以上，而银的反射只有70%；一般使用平面反光镜。聚光镜 　　专为荧光显微镜设计制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明视野聚光器的暗视野聚光器两种。还有相差荧光聚光器。 　　1．明视野聚光器 在一般荧光显微镜上多用明视野聚光器，它具有聚光力强，使用方便，特别适于低、中倍放大的标本观察。 　　2．暗视野聚光器 暗视野聚光器在荧光显微镜中的应用日益广泛。因为激发光不直接进入物镜，因而除散射光外，激发光也不进入目镜，可以使用薄的激发滤板，增强激发光的强度，压制滤板也可以很薄，因紫外光激发时，可用无色滤板（不透过紫外）而仍然产生黑暗的背景。从而增强了荧光图像的亮度和反衬度，提高了图像的质量，观察舒适，可能发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。 　　3．相差荧光聚光器 相差聚光器与相差物镜配合使用，可同时进行相差和荧光联合观察，既能看到荧光图像，又能看到相差图像，有助于荧光的定位准确。一般荧光观察很少需要这种聚光器。物镜 　　各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能（波长范围）适合于荧光。由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为了提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜。尤其在高倍放大 时其影响非常明显。因此对荧光不够强的标本，应使用镜口率大的物镜，配合以尽可能低的目镜（4×,5×，6.3×等）。目镜 　　在荧光显微镜中多用低倍目镜，如5×和6.3×。过去多用单筒目镜，因为其亮度比双筒目镜高一倍以上，但目前研究型荧光显微镜多用双筒目镜，观察很方便。落射光装置 　　新型的落射光装置是从光源来的光射到干涉分光滤镜后，波长短的部分（紫外和紫蓝）由于滤镜上镀膜的性质而反射，当滤镜对向光源呈45。倾斜时，则垂直射向物镜，经物镜射向标本，使标本受到激发，这时物镜直接起聚光器的作用。同时，滤长长的部分（绿、黄、红等），对滤镜是可透的，因此，不向物镜方向反射，滤镜起了激发滤板作用，由于标本的荧光处在可见光长波区，可透过滤镜而到达目镜观察，荧光图像的亮度随着放大倍数增大而提高，在高放大时比透射光源强。它除具有透射式光源的功能外，更适用于不透明及半透明标本，如厚片、滤膜、菌落、组织培养标本等的直接观察。近年研制的新型荧光显微镜多采用落射光装置，称之为落射荧光显微镜。 荧光显微镜

13 2 显微镜的构造 普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。 1.光学部分:接目镜 、 接物镜
2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件.它起着支持 调节 固定等作用. 3照明装置(聚光镜、 虹彩光圈、 反光镜等). 它使检视物放大,造成物象. 光学显微镜结构 　　普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。 　　◆机械部分 　　  显微镜结构图 （1）镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体。 　　（2）镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。 　　（3）镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。 　　（4）镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。 　　（5）物镜转换器(旋转器)简称“旋转器”：接于棱镜壳的下方，可自由转动，盘上有3－4个圆孔，是安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声时，方可进行观察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。转换物镜后，不允许使用粗调节器，只能用细调节器，使像清晰。 　　（6）镜台(载物台)：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔，我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器(推片器)，推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可使玻片标本作左右、前后方向的移动。 　　（7）调节器：是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。 　　①粗调节器(粗准焦螺旋)：大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台作快速和较大幅度的升降，所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野中，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物象。 　　②细调节器(细准焦螺旋)：小螺旋称细调节器，移动时可使镜台缓慢地升降，多在运用高倍镜时使用，从而得到更清晰的物象，并借以观察标本的不同层次和不同深度的结构。 　　◆照明部分 　　装在镜台下方，包括反光镜,集光器。 　　（1）反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱的时候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。 　　（2）集光器(聚光器)位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。 　　①聚光镜：由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光线射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的强弱。   ②光圈(虹彩光圈)：在聚光镜下方，由十几张金属薄片组成，其外侧伸出一柄，推动它可调节其开孔的大小，以调节光量。 　　◆光学部分 　　（1）目镜：装在镜筒的上端，通常备有2－3个，上面刻有5×、10×或15×符号以表示其放大倍数，一般装的是10×的目镜。 　　（2）物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有3－4个物镜，其中最短的刻有“10×”符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，最长的刻有“100×”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。 　　显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为10×，目镜为10×，其放大倍数就为10×10=100。 　　显微镜目镜长度与放大倍数呈负相关，物镜长度与放大倍数呈正相关。即目镜长度越长，放大倍数越低；物镜长度越长，放大倍数越高。

14 3 显微镜的物镜种类 微生物学研究用的显微镜物镜通常有： 低倍物镜(16mm，10) 高倍物镜(4mm，40-45) 油浸物镜(1.8mm，95-100)

15 根据放大倍率分3类： 低倍物镜：放大倍率1X-5X， 数值孔径 ； 中倍物镜：放大倍率>5x-25x， 数值孔径 ； 高倍物镜：放大倍率>25x-100x， 数值孔径 ；

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17 能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。
显微镜的两个重要参数 有效放大倍率：显微镜放大倍率的极限。 分辨率： 能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。 分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。 　　当选用的物镜分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。　

18 4 油镜的使用原理 油镜，即油浸物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。

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20 Image of pollen grain in focus (left) and out of focus (right)
成像质量 Brightness Resolution 分辨力 Image of pollen grain under good brightness (left) and poor brightness (right) Image of pollen grain with good contrast (left) and poor contrast (right) Image of pollen grain in focus (left) and out of focus (right) Image of pollen grain with good resolution (left) and poor resolution (right) Focus Contrast

21 油镜常标有黑圈或红圈，它是三者中放大倍数最大的。
油镜的特点 油镜常标有黑圈或红圈，它是三者中放大倍数最大的。 使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。 这种油常选用香柏油，香柏油的折射率n＝1.52，而玻璃的折射率n＝1.52。 油镜的基本原理 :58:21 易生物仪器 浏览次数：57 网友评论 0 条 （一）油镜头的辨认 油镜头上常刻有OI(oil immersion)或HI（homogeneneous  immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，在低倍物镜、高倍物镜和油镜3物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numerical  aperture） 关键词：油镜基本原理 （一）油镜头的辨认 油镜头上常刻有OI(oil immersion)或HI（homogeneneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，在低倍物镜、高倍物镜和油镜3物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numerical aperture）最大，而工作距离最短。 （二）显微镜的分辨率 显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它分辩率的大小。分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比。  D=λ/ 2NA 从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。 数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积；     影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。 当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n= 1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角（图5—2A）。当以香柏油 （n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射（图5—2B），不仅增加了视野的照明 度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为0.55μm。当使用数值孔径为0.65的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为 0.42μm；而使用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间的距离则为0.22μm。

22 当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。
如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系；当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样视野的照明度就减低了 。

23 1、 数值孔径 利用油镜不但能增加照明度；更主要的是能增加数值孔径。因为显微镜的放大效能由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度(称镜口角)的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示： NA=数值孔径 n= 介质折射率 α—最大入射角 即镜口角 数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依据； 2 sin a = n A N ×

24 A N = 2 l 2、D:是指显微镜能辨别物体两点间最小距离。
可见光的波长为 微米，平均波长为0.55微米。若用数值孔径为0.65的物镜，则D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。这表示被检物体在0.42微米以上时可被观察到，若小于0.42微米就不能视见。如果使用数值孔径为1.25的物镜，则D=0.22微米。凡被检物体长度大于这个数值，均能视见。由此可见，D值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。 根据上式，可通过：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高分辨力。 A N = 2 l D

25 3、放大率： 显微镜放大物体，首先经过物镜第一次放大造象，目镜在明视距离造成第二次放大象。放大率就是最后的象和原物体两者体积大小之比例。因此，显微镜的放大率（V）等于物镜放大率（V1）和目镜放大率（V2）的乘积，即： V=V1×V2

26 8.1.4 操作步骤 1、取镜 2、调节光源 3、低倍镜观察 4、高倍镜观察 5、油镜观察
油镜观察  油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。

27 使用油镜按下列步骤操作： 1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。 2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。 4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。

28 3. 将各部分还原，将接物镜转成八字形，再向下旋。罩上镜套，然后放回镜箱中。
注意事项 1. 使用显微镜时应据不同的物镜而调节光线。 2. 油镜使用完毕，移开物镜镜头，取下标本片。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾少量二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头，可用绸布擦净显微镜的金属部件。 3. 将各部分还原，将接物镜转成八字形，再向下旋。罩上镜套，然后放回镜箱中。

29 2 细菌简单染色和革兰氏染色 2.1 目的与要求 掌握细菌涂片标本的制备 掌握革兰氏染色法的步骤和关键点 识别细菌革兰氏染色结果

30 8.2.2 实验材料 菌种 牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种； 仪器 显微镜； 材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。 染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液；

31 8.2.3 实验原理 染色的意义 虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。

32 简单染色法 所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。
在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子：带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。

33 革兰氏染色法 是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰（Hans Christian Gram，1853年－1938年）于1884年所发明 原理 ：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。 实验方法 步骤 　　革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： 　　1）涂片固定。 　　2）草酸铵结晶紫染1分钟。 　　3）自来水冲洗。 　　4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。 　　5）水洗，用吸水纸吸去水分。 　　6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。 　　7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。原理 　　通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。 　　染色的差异主要是由于阴性与阳性细菌细胞壁的差异所应起的。 　　①革兰氏阳性细菌的细胞壁 　　G+细菌细胞壁具有较厚（20-80nm）而致密的肽聚糖层，多达20层，占细胞壁成分的60%～90%，它同细胞膜的外层紧密相连（图2-9）。有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid），也称胞壁质（murein），它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸带负电荷，它在细胞表面能调节阳离子浓度。磷壁酸与细胞生长有关，细胞生长中有自溶素（autolysins）酶类起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能，阻止胞壁过度降解和壁溶。 　　如果细胞壁的肽聚糖层被消溶，G+细胞成为原生质体（protoplasts），细胞壁不复存在，而只存留细胞膜。除链球菌外，大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白质。 　　②革兰氏阴性细菌的细胞壁 G—细菌细胞壁比G+细菌细胞壁薄（15～20nm）而结构较复杂，分外膜（outer membrane）和肽聚糖层（2～3nm）（图2-10）。在细胞壁和细胞质膜之间有一个明显的空间，称为壁膜间隙（periplasmic space）。 　　外膜 G—细菌细胞壁外膜的基本成分是脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），它同细胞质膜相同之处也是双层类脂，但除磷脂外还含有多糖和蛋白质。 　　LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特异多糖。O-特异多糖由重复分支的碳水化合物分子组成，含有已糖（葡萄糖、半乳糖和鼠李糖）和二脱氧已糖。由于糖的种类不同，使各种G—细胞具有不同特性的LPS。核心多糖（core polysaccharide）的主要组分是酮脱氧辛酸（ketodeoxyoctonate, KDO）。 　　外膜中还含有几种蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用（porin），调控外界分子进入细胞；有的蛋白分子可以作为噬菌体的受体；许多G—细菌对高等生物有致病性是由LPS的成分决定的，它的毒性组分常称为内毒素（endotoxins）。 　　肽聚糖层 G—细菌细胞壁的肽聚糖层很薄，在大肠杆菌和其它细菌中仅有单 　　层。肽聚糖层和外膜的内层之间通过脂蛋白连接起来。 　　壁膜间隙 G—细菌细胞壁的外膜与细胞质膜之间存在明显的壁膜间隙，一层薄的肽聚糖处于其间，肽聚糖层和细胞质膜之间的间隙较宽，肽聚糖层至外膜之间的间隙较窄。大肠杆菌的壁膜间隙宽度为12～15nm，呈胶胨态。其间含有三类蛋白质：水解酶，催化食物的初步降解；结合蛋白，启动物质转运过程；化学受体（chemoreceptors），在趋化性中起作用的蛋白。染色结果 　　革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。 临床意义 　　其重要的临床意义在于：1.鉴别细菌 2.选择药物 3.与致病性有关：革兰氏阳性菌能产生外毒素，革兰氏阴性菌能产生内毒素；而内毒素主要是指革兰氏阴性菌胞壁成分中的脂多糖，两者的致病作用不同。 特性 　　染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用龙胆紫染色，加碘液媒染后用酒精脱色，再用蕃红复染。染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G+）。被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（G-）。革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因素有关。致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、碳疽杆菌等属革兰氏染色阳性菌。百日咳杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性。所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。 鉴定原理 　　  革兰氏染色 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。 实验流程 　　1、 取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。 　　2、 涂片： 　　液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 　　固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。 3、 晾干：让涂片在空气中自然干燥。 　　4、 固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。 　　5、 染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。 　　6、 水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。 　　7、 媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 　　8、 脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。 　　9、 复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束。 可能误差 　　在实验中经常会出现假阳性和假阴性的结果，假阳性主要是由于脱色不完全，可能是由于涂片过厚，或者是结晶紫染色过度，导致脱色不完全。假阴性可能是因为细胞固定过度，造成细胞壁通透性的改变，而出现假阴性结果；另外，细胞培养时间太长，可能已经有部分细胞发生死亡或者自溶，也导致细胞壁通透性的改变而出现假阴性结果。 染色结果：革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。

34 革兰氏染色法—样品制备 载玻片准备：取一张清洁载玻片，用蜡笔在其背面画出二个有一定间隔、直径约 1～2cm的涂抹范围，用数字或符号做好标记。
涂片：将接种环在火焰上烧灼灭菌，冷却后取菌液直接涂布在标记的涂抹范围内。接种环在火焰上烧灼灭菌。 干燥：涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于离酒精灯火焰约半尺高处缓慢烘干，切不可放在火焰上烧干。 固定：将干燥后的涂片用片夹夹住，使涂抹面向上缓慢通过火焰 3 次，然后自然冷却。固定即可杀死细菌，并使细菌固着于玻片上，以免染色时脱落；又可使细菌蛋白凝固，而易着色。

35 革兰氏染色法步骤-1

36 革兰氏染色法步骤-2 一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。
3）自来水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。 7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。

37 实验关键步骤和注意点： 玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。 挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。涂片厚度适当。 固定温度适当。 革兰氏染色成败的关键是脱色时间，脱色程度适当。 染色过程中勿使染色液干涸。

38 8.3 实验报告 1 实验结果 分别绘出你在油镜下观察到的菌株形态并标出革兰氏染色结果。

39 2 思考题 （1） 用油镜便于观察细菌的依据是什么？ （2）使用油镜应特别注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？
（3）当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求？应如何调节？ （4）影响显微镜分辨率的因素有哪些？ （5）涂片后为什么要进行固定？固定时应注意什么？ （6）革兰氏染色步骤是什么？其中关键步骤是什么？ （7）为什么必须用培养24h的菌体进行革兰氏染色？