第三单元 免疫凝集类实验.

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1 第三单元 免疫凝集类实验

2 验证实验一 直接凝集实验

3 颗粒性抗原与相应抗体直接反应，在适当电解质参与下出现的肉眼可见的凝集现象。
常用的试验方法有玻片凝集法和试管凝集法。 本实验以试管法凝集试验——肥大试验（Widal test）验证凝集反应及其特点。

4 Widal test原理 将已知的颗粒性抗原（伤寒沙门菌）定量加入到系列倍比稀释的待测血清中，根据各血清稀释度凝集情况，测定血清中有无相应抗体及其相对含量。

5 抗体 待测伤寒沙门菌免疫血清、抗原 伤寒沙门菌诊断菌液（7×108/ml)、生理盐水
实验器材和材料 器械 试管、吸管、恒温水浴箱等 试剂 抗体 待测伤寒沙门菌免疫血清、抗原 伤寒沙门菌诊断菌液（7×108/ml)、生理盐水

6 实验方法（Widal test） 取试管7支，依次编号并做好标记。 每支试管中加生理盐水0.5ml。 倍比稀释血清：
取1∶20稀释的待测血清0.5ml加入到第1管，混匀后吸取0.5ml加入到第2管，如此连续稀释至第6管，混匀后吸取0.5ml弃去；第7管不加血清作为阴性对照。 加诊断菌液： 每管加伤寒沙门菌H或O诊断菌液0.5ml，此时各管血清最终稀释度依次为1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560 摇匀后置37℃水浴2～4h，取出观察结果或放室温过夜，次日观察结果。

7 试管凝集法操作程序 试管号 1 2 3 4 5 6 7 生理盐水（ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
试管号 生理盐水（ml) 待测血清（ml) 伤寒O菌液(ml) 血清稀释度 : : : : : :2560

8 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃掉0.5 试管凝集试验原理 菌液 结果

9 结果判断 实验结果 对照管：应无凝集现象 试验管：“++++”：上清液澄清，细菌全部凝集，凝集块全部沉于管底
将试管置于有良好光源和黑色背景下，观察管底凝集物的范围和上清液的浊度，记录凝集程度，判断凝集效价用++++、+++、++、+、-等符号记录凝集效价。 对照管：应无凝集现象 试验管：“++++”：上清液澄清，细菌全部凝集，凝集块全部沉于管底 “+++”：上清液稍混浊，细菌大部分凝集并沉于管底 “++”：上清液较混浊，约50%的细菌凝集并沉于管底 “+”：上清液混浊，仅少量细菌凝集 “-”：不凝集，液体浊度与对照管相同 血清抗体效价：试验管出现“++”以上的凝集现象即可判断为阳性；以出现“++”凝集的最高血清稀释度为该待测血清的抗体效价。

10 注意事项 凝集反应只有在抗原抗体比例适当时，才能出现肉眼可见的反应 一般情况下，随着血清浓度的逐渐稀释，凝集反应越来越弱，但在抗体浓度过高时，反而无凝集现象出现，此为前带现象，出现该情况时，须加大抗体稀释倍数重新试验。 直接凝集试验也可以用玻片法 以鉴定伤寒沙门菌为例：取洁净载玻片2张，在玻片的左上角分别标明“1”、“2”； 加入已知抗体（伤寒沙门菌诊断血清）和待测菌液（伤寒沙门菌或其他细菌）。 1 生理盐水 + 伤寒杆菌 1:40 伤寒杆菌诊断学清 2 生理盐水 + 大肠杆菌 1:40 伤寒杆菌诊断学清 玻片凝集试验鉴定伤寒沙门菌

11 (slide agglutination test)
玻片凝集试验 (slide agglutination test) 在玻片上 颗粒性抗原与相应 抗体直接结合 +  Y ？  Y 出现肉眼可见的凝集现象 +  Y Y

12 结果分析 将载玻片置黑色背景上观察。 在诊断血清中，混悬液由混浊变澄清并出凝集物，则为阳性结果；混悬液仍为匀混浊的乳状液，则为阴性结果。
肉眼观察不够清晰者，可在低倍镜下观察。

13 实验讨论 肥大试验是一种经典的半定量试管凝集试验。在临床上主要用已知的伤寒沙门菌O或H抗原检测血清中有无相应的特异性抗体及其效价，以协助诊断伤寒病或供流行病学调查。 凝集反应只有在抗原抗体比例适当时，才能出现肉眼可见的凝集现象。 临床上开展的外斐反应是利用与立克次体有共同耐热性多糖抗原的变形杆菌OX19、OX2、OXk菌株代替立克次体作为已知抗原，与患者血清进行凝集试验，以辅助诊断斑疹伤寒、恙虫病等立克次体疾病。 现有OX19、OX2、OXk三种诊断菌液和待测血清，请写出利用试管凝集法进行的外斐试验的操作步骤。

14 思考题 为什么临床上不直接利用立克次体作为已知抗原进行血清学诊断呢？

15 验证实验二 间接凝集实验

16 间接凝集实验（indirect Agglutination Test)
将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关、大小均匀的惰性载体颗粒表面，使其成为致敏载体，然后再与相应抗体（或抗原）结合，在适当电解质存在的条件下，载体颗粒被动地发生凝集，出现肉眼可见的凝集现象。 以胶乳凝集试验检测类风湿因子（rheumatoid factor,RF）为例验证间接凝集实验的原理和特点

17 实验原理 类风湿因子（RF）是一种抗变性IgG的自身抗体，具有与人或动物变性IgG结合的特点。将处理过的人IgG与聚苯乙烯胶乳颗粒结合成致敏颗粒，当待测血清中含有RF时，则与致敏颗粒上变性的IgG发生反应，出现凝集现象。

18 胶乳颗粒 人IgG 致敏胶乳 致敏 NS 待测RF 凝集颗粒

19 实验器材 器械 黑色方格反应板、毛细滴管、试管、试管架、吸耳球、恒温水浴箱等 试剂 人IgG致敏胶乳试剂（市售类风湿因子检测试剂）
类风湿因子阳性血清和阴性血清：临床标本筛选获得 待测血清

20 实验方法 待测血清、阳性血清、阴性血清分别用生理盐水作1∶20稀释。
在黑色方格反应板上取3个格，用毛细滴管分别滴加稀释待测血清、阳性血清、阴性血清各1滴，然后每格加入人IgG致敏胶乳试剂1滴。 连续轻轻摇动反应板，2～3分钟后观察结果。

21 结果判断 若胶乳颗粒凝集且液体澄清者为阳性反应 胶乳颗粒不凝集仍保持均匀胶乳状者为阴性反应

22 注意事项 试剂应4℃保存，严禁冻结，用时摇匀； 所有试验器皿和反应板均应洗净、干燥；
若阴性对照出现凝集，则表示致敏乳胶试剂有质量问题，不能使用。

23 实验结果分析和讨论 胶乳凝集试验方法简便、快速，但易发生非特异性凝集反应，试分析如何判定实验的非特异性凝集反应。
判断凝集或凝集程度除目测外，是否还有其他方法？

24 验证实验三 间接凝集抑制实验

25 概 念 间接凝集抑制试验（indirect agglutination inhibition test）是以抗原致敏的载体及相应抗体作为诊断试剂，用于检测标本中是否含有与致敏抗原相同的抗原的试验。检测时先将抗体试剂与待测标本混合，再加入抗原致敏的载体。若标本中没有与抗体试剂相对应的抗原，则抗体试剂与随后加入的致敏载体上的抗原结合而出现凝集；若标本中存在与抗体试剂相对应的抗原，抗体先与之结合，随后加入的致敏载体上的抗原则无抗体结合，凝集反应被抑制。 本实验以检测尿绒毛膜促性腺激素（HCG）的妊娠免疫诊断试验为例进行胶乳凝集抑制现象的观察和验证。

26 实验原理 孕妇尿液中含有HCG，正常人尿中无HCG。当向孕妇尿中加入一定量抗HCG抗体时，尿HCG即与抗HCG发生抗原抗体反应，此时，再加入胶乳抗原（吸附有HCG的聚苯乙烯胶乳颗粒），因抗体被消耗，故不能发生凝集，即凝集被抑制，为凝集抑制试验阳性；反之，若待检尿中无HCG（非妊娠尿），则加入的抗HCG抗体未被结合和消耗，可与随后加入的乳胶抗原发生反应，出现肉眼可见的细小颗粒，即凝集未被抑制，为凝集抑制试验阴性。

27 抗原抗体复合物 特异结合 抗HCG 待测尿液(含HCG) ＋ NS 致敏胶乳 无凝集颗粒为阳性

28 待测尿液(无HCG) 抗HCG ＋ 无结合 NS 致敏胶乳 有凝集颗粒为阴性

29 实验器材和材料 器械 黑色方格反应板、毛细滴管 试剂与标本 胶乳抗原（HCG致敏的胶乳颗粒）、抗HCG抗体（商品化）
孕妇尿液、正常人尿液、待测尿液。 生理盐水

30 实验方法 在黑色方格反应板上取3个格，用毛细滴管分别加待测尿液、孕妇尿液、正常人尿液（或生理盐水）1滴，然后每格加抗HCG抗体1滴，轻轻摇动1～2min。 于上述3格中各滴加胶乳抗原1滴，轻轻摇动2～3min后观察结果。

31 结果判断 样本 待测尿液 孕妇尿液 正常人尿(或NS) 现象 凝集 或不凝集 不凝集 凝集 结果判定 非妊娠尿 或妊娠尿 阳性对照 阴性对照
现象 凝集 或不凝集 不凝集 凝集 结果判定 非妊娠尿 或妊娠尿 阳性对照 阴性对照 如肉眼观察结果不清楚，可用显微镜在低倍镜下观察

32 注意事项 待测尿液宜采用晨尿，不能及时检测检测的标本应保存于2~8℃，不能使用严重蛋白尿、血尿、菌尿标本；
试剂应4℃保存，切勿冻存。使用前使试剂接近室温并摇匀； 应同时设置阳性、阴性对照，以排除非特异性凝集； 所加液滴应大小一致； 结果应在强光下观察，观察时应置黑色背景下或稍倾斜反应板。

33 实验结果分析和讨论 妊娠免疫诊断试验是临床常用的经典胶乳凝集抑制试验，操作简便、快速、特异性强，停经35～40天以上的孕妇可测得阳性结果。需注意的是，绒毛膜上皮癌、葡萄胎及睾丸畸胎瘤病人尿中HCG含量远较正常妊娠尿液为高，将尿液作1∶200稀释后仍可呈阳性反应。 待测尿液以晨尿为好。测试时应注意标本及各诊断试剂加入的顺序，并设立阳性和阴性对照。试分析若随意变更加样顺序，如先加标本、再加胶乳抗原，最后加抗HCG或先加胶乳抗原、再加抗HCG，最后加标本，结果如何？  凝集抑制试验可用于确证呈阳性反应的间接凝集实验是否是非特异凝集反应，试讨论如何进行该项实验？

34 不完全抗体检测的实验设计 （设计性实验）

35 实验目的 采用红细胞作为凝集试验的抗原，创造条件设法使相邻的红细胞靠近、聚拢、凝集从而达到对红细胞不完全抗体的检测目的。

36 问题背景资料 抗体与相应抗原结合后，在适宜的介质参与下可出现可见的抗原抗体反应。但有些分子较小的7S的IgG类抗体，体积小，长度短，在适宜介质中与相应抗原结合后不出现可见反应，这种抗体称为不完全抗体，如抗红细胞Rh抗原的抗体等，这种抗红细胞不完全抗体的存在是引起输血不良反应的主要原因之一，有必要设计检测不完全抗体，特别是针对红细胞抗原不完全抗体的的检测方法。

37 实验设计的策略 不完全抗体只含有一个抗原结合位点， 能与相应抗原结合，但不产生可见反应，因此也称单价抗体 。
不完全抗体只含有一个抗原结合位点， 能与相应抗原结合，但不产生可见反应，因此也称单价抗体 。 抗红细胞不完全抗体与红细胞结合后，因抗体分子小，不能有效地连接红细胞，仅使红细胞处于致敏状态，而不出现可见的凝集反应。 在实验设计时，基本的思路是采用红细胞作为凝集试验的抗原，创造条件设法使相邻的红细胞靠近、聚拢、凝集从而达到对红细胞不完全抗体的检测目的。

38 实验方案讨论 凝集反应可分为哪两个阶段？其中可见反应阶段主要受哪些因素影响？可否根据影响因素，通过设置低离子强度介质以降低红细胞的Zeta电位和加入高价阳离子盐类以中和红细胞表面负电荷等来促使红细胞凝集？此时又如何判断是特异性凝集还是非特异性凝集？ 红细胞表面的不完全抗体是IgG，即免疫球蛋白，此时若在反应体系中加入抗人球蛋白，会出现何结果？抗人球蛋白如何制备？ 如何检测血清中未与红细胞结合和与红细胞结合的不完全抗体？

39 免疫凝集分析系统——全自动血型分析系统 （临床见习）

40 基本原理 全自动血型分析系统采用柱凝集血型诊断系统试剂卡技术和数字图像处理技术自动实现人血样本的体外免疫血液检测。
ABO/Rh 血型诊断试剂卡是基于独特的柱凝集技术原理而设计的。该卡是在一种特制的塑料卡上设计有6个微柱，每个微柱中均装有一定数量具有分子筛作用的玻璃珠，并分别预置了抗A、抗B、抗D特异性抗体的试剂。当受检者红细胞进入测试柱与相应抗体反应并经低速和高速双相离心后，发生凝集的红细胞被阻滞在玻璃珠的上层（阳性），而未凝集的游离红细胞则会在离心力的作用下通过玻璃珠介质之间的间隙沉积于柱的底部（阴性）。由此可将凝集红细胞与未凝集红细胞分开，达到鉴定ABO/Rh血型的目的。

41 见习内容与要点 了解该分析系统的整体结构和工作性能 掌握人血样本体外免疫血液自动检测的基本原理 熟悉整个操作流程 全自动血型分析系统

42 整体结构 本实验以AutoVue＠全自动血型分析系统用于人红细胞ABO/Rh血型的正定型为例进行介绍 计算机 试剂卡 打印机
AutoVue Innova 试剂卡 打印机 不间断电源(可选) 储液桶

43 AutoVue Innova 的功能 样本的识别与加样 红细胞混悬与制备 试剂的识别与分配 孵育 离心 结果的阅读与解释 试剂卡的保存与移动

44 AutoVue Innova 的检测菜单 抗体筛选 抗体鉴定 ABO/Rh 定型 直接抗人球蛋白实验 ABO反定型 酶实验 Rh 表型鉴定
特殊血型抗原鉴定 质控实验 ABO/Rh 定型 ABO反定型 Rh 表型鉴定 病人/ 献血员主侧与次侧交叉配血

45 用于人红细胞ABO/Rh 血型正定型的原理
柱凝集血型诊断系统试剂卡 每张卡上有六个微柱 微柱内装有一定数量、大小均一的玻璃珠和分别预置了含抗A、抗B、抗D特异性抗体 受检者红细胞进入测试柱与相应抗体反应经低速和高速双相离心，发生凝集的红细胞被阻滞在玻璃珠的上层（阳性），而未凝集的游离红细胞则会通过玻璃珠介质之间的间隙沉积于柱的底部（阴性）,达到血型鉴定的目的。

46 微柱凝胶试验示意图

47 见习内容 标本采集和要求 血液的采集 采集后的标本可室温保存4小时，并在6小时内测定。
用真空采血针取肘静脉血3ml放入含有干燥抗凝剂的抗凝管中，并做好标识。 采集后的标本可室温保存4小时，并在6小时内测定。

48 故每一试剂卡可用于2份人血标本ABO/Rh鉴定
三号柱：抗-D试剂 (抗-RH1) 四号柱：抗-A试剂 五号柱：抗-B试剂 六号柱：抗-D试剂 (抗-RH1) 故每一试剂卡可用于2份人血标本ABO/Rh鉴定

49 技术流程 全自动血型分析系统基本技术流程图

50 样品装载意示 样本装载量:42个试管位，36个位于可移动的扇形架中，6个固定位置
独立的样本装载门,主要处理区域的操作不会受到干扰而中断 患者样本放置在仪器正面的一扇门后面，位于AutoVue的左边，由移液探针执行样本吸取并将样本输送到检测区这一步骤，请参见黄色线描出的部分。 样本加样

51 AutoVue可以自动进行结果的读取与分析,
结果读取 AutoVue可以自动进行结果的读取与分析, 自动读取器在系统内部离心机所在位置附近 读取试剂卡两面的信息 高清晰度图像处理系统 标准化和客观的反应分级 如果需要则可进行结果的人工判读 读取QC来定标试剂卡

52 结果报告 若红细胞聚集在玻璃珠上部，则表明红细胞发生凝集，是阳性反应；红细胞沉积在玻璃珠底部，则表明红细胞未发生凝集，是阴性反应。
基于图像分析的判读系统会自动判读ABO血型（A/B/AB/O型 ，如第一、二柱均为阴性反应，则判为O型；第一柱呈阳性反应、第二柱呈阴性反应，则判为A型；第一柱呈阴性反应、第二柱呈阳性反应，则判为B型。）和RH血型（阳性/阴性，第三柱呈阳性反应判为Rh阳性；第三柱呈阴性反应判为Rh阴性。）。 O型Rh阳性 A型Rh阳性

53 结果为1+到3+，可能存在弱抗原，需进一步验证。
结果判读标准：4+ ： 凝集的细胞全部处于微管的顶部 3+ ： 80%的红细胞沉在微管的上端1/3之内 2+ ： 80%的红细胞沉在微管的上端2/3之内 1+ ： 80%的红细胞沉在微管的下端2/3之内 0： 阴性。100%的红细胞沉在微管的底部 结果为1+到3+，可能存在弱抗原，需进一步验证。

54 注意事项 试剂卡如冷藏（2至8℃）保存，使用前应在室温复温30min至60min；
有些试剂卡成份可被视为具有危险性或潜在的传染性，应按照适用的指导原则和规定处理； 不适宜的存储条件可能会影响产品质量。如每个试剂盒卡的架子外面都贴有一个圆形的温控指示点。如果指示点圆圈内为蓝色，说明试剂卡曾被暴露在可能影响产品质量的温度环境中，使用这些试剂卡时可能出现假阴性的检测结果。请勿使用这样的试剂卡； 请勿使用表面破损的试剂卡（如封口膜破裂，柱中有裂隙或气泡）或微柱内试剂液体明显干涸（即液面低于玻璃珠介质）或褪色的试剂卡（由细菌污染引起，可导致假阳性检测结果）。

55 仪器维护和质控 每日维护 执行探针清除污染：点击维护菜单，点击探针清除污染按钮，点执行，根据仪器提示进行操作，首先在10ml小瓶中装好0.1mol/L的NaOH 溶液，放入试剂架相应位置，点继续，系统自动进行清洗。 清除废弃物容器中的废弃试剂卡：点击废弃物舱门按钮，打开废弃物舱门，清出废弃物容器并提起固定架，取出废弃物袋，插入一新的废弃物袋。 清空液体废弃物：确认设备电源处于关闭状态，卸下液体废弃物容器的连接管，根据所在实验室处理液体废弃物的指导原则处置液体废弃物并清洁容器，重新连接好废液连接管。

56 每周维护 质控 试液回路清洁：点击维护菜单，点击试 液回路清洁按钮，点执行，根据仪器提示进行操作。
设备清洁：点击 维护 菜单，点击设备清洁，点执行，根据仪器提示进行操作。 质控 当在系统上运行常规检测时使用质控品作为样本进行内部质控。 使用质控试剂卡进行质控：点击质控自动读取器按钮，点击执行，显示质控自动读取器对话框，按照屏幕提示启动自动读取器质控步骤。

57 广州医学院 徐霞 见习报告 通过见习，叙述全自动血型分析系统的检测原理。 简述全自动血型分析系统的仪器构成、操作流程、影响因素及解决的措施。
全自动血型分析系统可以检测哪些项目？有何临床意义？ 广州医学院 徐霞