实验二、叶绿素a和同化系数Q的测定.

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1 实验二、叶绿素a和同化系数Q的测定

2 一、目的要求 1、测定水体中的叶绿素a含量和同化系数； 2、掌握初级生产力的测定和计算方法。

3 二、方法概述 1、分光光度法测叶绿素 浮游植物是海洋最主要的初级生产者，它们所生产的有机物和贮存的能量是海洋食物链的基础。因而海洋初级生产力的测定对海洋有机生产能力以及渔业资源开发利用潜力的估算有着十分重要的意义。海洋初级生产力的测定有C14示踪法和叶绿素法。本实验主要介绍叶绿素法，该方法是根据一定条件下，植物细胞内叶绿素含量和光合作用产量之间存在一定的相关性，从而根据叶绿素含量和同化系数（coefficient of assimilation）或称同化指数（assimilation index）来计算初级生产力。

4 叶绿素的测定最常应用的方法是用分光光度计测定叶绿素在丙酮溶液中的光密度，其计算公式如下：
chl-a = 11.85E664－1.54 E647－0.08 E630 ＝Cchl-a (1) chl-b = E647－5.43 E664－2.66 E630 ＝Cchl-b (2) chl-c = E630－1.67 E664－7.60 E647 ＝ Cchl-c (3) 式中，各波长的E值为用1cm光程比色皿、经750nm波长校正后的吸光值，即上述E值应扣除E750的数值。

5 由于叶绿素a是浮游植物任一种群都具有的特征，而叶绿素b或c不是任一种群都有，因此，通常用叶绿素a（Chl-a）表示初级生产力水平。故
Chl-a（mg/m3）= （4） 式中，Cchl-a 为（1）式的计算结果，V丙酮为丙酮的体积（mL），V水样为过滤水样体积（L）。

6 2、荧光光度法测叶绿素 式中，Rb—酸化前荧光值；
近年来，海水叶绿素a含量测定的分光光度法已逐渐被较简便且灵敏度高的萃取荧光法代替。其原理是叶绿素a的丙酮萃取液受蓝光激发后产生红色荧光，用荧光计在波长670nm测定提取液酸化前后的荧光值，按下式计算海水叶绿素a的含量： (5) 式中，Rb—酸化前荧光值； Ra—酸化后荧光值； R—纯叶绿素a的酸化因子(随仪器而异）。

7 因 ，故（5）式成为： （6） 式中， Fd—测定时荧光计所用量程的换算因子(mg/m3)，其值的确定有几种方法，具体为：

8 ⑴标准叶绿素a校正法：用纯叶绿素a配成母液，把母液稀释成一系列不同浓度的溶液并分别测定荧光读数，最后用直线回归法算出标定线的斜率，即Fd。
⑵分光光度计校正法：取一定体积处于指数生长期的单细胞藻类，按分光光度法测定叶绿素a的方法，测其吸光值E，按（1）式计算该提取液的Cchl-a。然后将它在荧光计上测定荧光值Rb，按（7）式求得Fd。本实验采用分光光度计校正法。 (7)

9 3、同化系数的测定 把叶绿素a含量换算成调查海区的初级生产力，必须乘以一个比例系数，称为同化系数，用Q表示。一般在光饱和条件下，同化系数的值最大。但应当指出，不同类型的藻类种群或同一种群在不同的环境中，同化系数是不一样的。因此，最好先用C14示踪法现场测定同化系数。在无C14示踪法测定Ｑ的条件下可根据浮游植物光合过程中释放出氧的量换算成有机碳的固定量，以此固定值除以叶绿素a和培养时间即为同化系数Q。

10 CO2＋H2O → CH2O＋O2，将所产生的氧的单位转换成固定碳的单位，则有：
若假设符合光合作用的理想方程为 CO2＋H2O　→ CH2O＋O2，将所产生的氧的单位转换成固定碳的单位，则有： （8） 式中Q—同化系数，单位为mgC(mgChl-a)-1h-1； h—光照时间（h）； Chl-a—光照水样的叶绿素a含量（mg/m3）； Ol、Od—分别为“白”瓶和“黑”瓶中的溶解氧含量（mgO2/L）。

11 式中，PP—每日生产力（mgC/m3d）；
4、初级生产力的估算 PP=Chl-a×Q× (9) 式中，PP—每日生产力（mgC/m3d）； Chl-a －海洋水样的叶绿素a值（用荧光法测定的数值，单位mg/m3）； D—每日的光照时间，冬天取12h，夏天取13h。

12 三、仪器与试剂 1、仪器和玻璃器皿 752紫外光栅分光光度计1台 GFY－160荧光光度计1台
LRH-250-G型光照培养箱 MR荧光光度计1台 离心机1台 过滤器1个 医用真空吸引器 一台 0.45μm微孔醋酸纤维滤膜若干张　　 250mL BOD瓶2个（黑白各1个） 黑布若干块 碘量瓶 2个　 具塞刻度试管4支 mL量筒1个　 　水样桶2个 碱式滴定管1根 mL移液管 1支 mL移液管 3支 1mL移液管 1支 mL移液管 1支

13 2、试剂 （1）90% 丙酮：100mL蒸馏水加上900mL丙酮贮于棕色瓶中。 （2）1% MgCO3：取1g MgCO3溶于100mL蒸馏水中，使其过饱和，盛入100mL点滴瓶中，使用前摇匀。 (3) 0.01mol/L Na2S2O3溶液。 （4） mol/L KIO3标准溶液。

14 （5）MnCl2溶液：210g MnCl2·4H2O溶于水并稀释至500mL。
（6）碱性KI溶液：250g NaOH在搅拌下溶于250mL水中，冷却后加75g KI稀释至500mL盛于具橡皮塞的棕色试剂瓶中。 （7）1+1 H2SO4 （8）1＋3 H2SO4 （9）0.5％淀粉指示剂 （10）固体KI

15 四、实验内容 1、换算因子Fd的确定 用量筒平行移取二份某海区水样（记为A样）约100－500mL（视浮游植物含量而定，移取水样前应将水样混匀），加入1mL 1% MgCO3溶液混匀后，用微孔滤膜（ =45mm，0.45M）真空抽滤（真空度小于0.5atm）。将滤膜转移至10mL具塞的试管中，加入10mL90% 的丙酮溶液，混匀，置冰箱冷冻16-24小时（本实验由于时间关系，应置冰箱一周）后取出，用玻棒搅匀，待温度达室温时离心10min（离心速度 = 3000－4000r/min），取上清液于1cm比色皿中。

16 先用752紫外可见光光度计于750，664，647，630nm波长测其消光值，按（1）和（4）式计算Cchl-a和Chl-a浓度。测定时用90％的丙酮溶液调零。
接着将此提取液用荧光计测其荧光值（Rb），按（7）式计算Fd。测定时荧光计若用GFY-160，则激发波长为360nm、发射波长670nm、负高压500mV、狭缝0.1、灵敏度档×3。若用960MC，则参考本实验附录（四）。

17 2、同化指数的测定 取二只250mL BOD瓶，其中一只用黑布包裹使之不透光，记作“黑”瓶，另一只则为“白”瓶。取水样A，在现场注满上述二瓶，分别置于与取水样相同的水深位置，使阳光能充分照射（本实验由于条件所限，置于LRH-250-G型生化培养箱，温度30℃，４×30Ｗ荧光灯对称照明，其使用方法详见本实验附录五），光照2～3小时后，取出瓶子，逐一测量溶解氧含量，分别将“白”和“黑”瓶的数值记为Ol和Od，将结果记录于表2。按（8）式计算同化系数Q，式中的Chl-a即为表1中的Chl-a数值。

18 3、水样叶绿素a荧光法的测定 取上述实验不同站位的水样（记为水样B）100~500mL（视浮游植物含量而定），过滤，按实验步骤1提取后，分别用GFY－160和960MC荧光分光光度计测定提取液的荧光值Rb，数据记录于表3，按(6)式计算水样荧光法测定的叶绿素a浓度。

19 根据表2的数据和实验步骤3的结果，按（9）式计算该样水域的初级生产力水平PP。
4、初级生产力的估算 根据表2的数据和实验步骤3的结果，按（9）式计算该样水域的初级生产力水平PP。 Ol (mg/L) Od (mg/L) Ol－Od (mg/L) 光照时间 (h) Chl-a (mg/m3) Q (mgC/mgChl-ah) 水样A

20 表1 Fd值测定数据记录表 项目 GY-160 960MC E750 E664 E647 E630 Ｖ(L) CChl-a Rb1 Fd1
(mg/m3) Ｖ(L) CChl-a Rb1 Fd1 Rb2 Fd2 样号 1 水样A 2 平均

21 表3 调查水域叶绿素ａ含量和初级生产力 项目 样号 1 水样B 2 平均 GFY-160 测定的Rb1 PP (mgC/m3d)
　表3　调查水域叶绿素ａ含量和初级生产力 项目 GFY-160 测定的Rb1 PP (mgC/m3d) 水样体积(L) Chl-a (mg/m3) 960MC测定的Rb2 Chl-a (mg/m3) PP(mgC/m3d) 样号 1 水样B 2 平均

22 五、讨论 1、测溶解氧时要注意哪些事项？ 2、本实验有哪些主要误差来源？
3、试分别计算水样A、水样Ｂ两平行样叶绿素ａ含量的相对偏差和水样Ｂ分别用两种荧光计测定计算的叶绿素ａ含量的相对偏差，并分析引起误差的可能的主要原因。

23 六、注意事项 １、水样采样：地点在芙蓉湖，A样和Ｂ样在 芙蓉湖内不同站位 ２、水样A和B均应作平行样。