结核病实验室诊断及新诊断工具 安徽省结核病防治研究所 安徽省胸科医院 王 庆.

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1 结核病实验室诊断及新诊断工具 安徽省结核病防治研究所 安徽省胸科医院 王 庆

2 一.结核病细菌学基础 二.结核病实验室诊断方法 三.结核病实验室新诊断工具

3 一.结核病细菌学基础 —结核分枝杆菌

4 分枝杆菌 1882年KOCH发现，至今已经发现100多种，有结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌、麻风杆菌。
引起肺结核的主要有人型、牛型、非洲、田鼠等结核分枝杆菌，称结核分枝杆菌复合群； (结核分枝杆菌是缓慢生长菌） 大部分非结核分枝杆菌不致病, 部分非结核分枝杆菌可引起人体类似结核样病变—非结核分枝杆菌肺病； 麻风分枝杆菌引起麻风病。 是一类细长略弯曲的长杆菌，由于细胞壁含有大量脂质，能抵抗酸酒精脱色能力，抗酸染色阳性。 致病性于菌体成分有关，荚膜-多糖；脂质-索状因子、磷脂、蜡纸D；蛋白质； 易发生形态、耐药、毒力、免疫性变异。 对干燥抵抗力强，对湿热、紫外线敏感。

5 分枝杆菌分类 分类 生长速度 菌落和色素产生 代表菌种 致病性 结核分枝杆菌复合群 生长缓慢 结核分枝杆菌、 结核病 牛分枝杆菌
分类 生长速度 菌落和色素产生 代表菌种 致病性 结核分枝杆菌复合群 生长缓慢 结核分枝杆菌、 结核病 牛分枝杆菌 非结核分枝杆菌 RunyonⅠ组 生长缓慢 菌落不见光时为淡黄色, 堪萨斯分枝杆菌 肺结核样病变 光照后则变为黄色或橙色 海分枝杆菌 结节与溃疡 RunyonⅡ组 在37℃生长缓慢 在暗处培养时菌落 瘰疠分枝杆菌 儿童淋巴结炎 呈橘红色 RunyonⅢ组 ～42℃下生长慢 通常不产生色素 鸟-胞内分枝杆菌 结核样病变， 多见于肺与肾 RunyonⅣ组 在25～45℃快速生长。 培养5～7天即可见到菌落 个别种产生色素 偶发分枝杆菌 极少致病 麻风分枝杆菌 人工培养基上不生长 麻风病

6 结核分枝杆菌 是一类细长略弯曲的长杆菌，由于细胞壁含有大量脂质，能抵抗酸酒精脱色能力，抗酸染色阳性。 缓慢生长菌。
致病性与菌体成分有关，荚膜-多糖；脂质-索状因子、磷脂、蜡质D；蛋白质。 易发生形态、耐药、毒力、免疫性变异。 对干燥抵抗力强，对湿热、紫外线敏感。

7 病灶中结核分枝杆菌菌群： 结核病变中有四种不同代谢状态的结核菌群,它们对化学药物的反应各不相同：
A群：快速生长菌，生长繁殖旺盛，致病力和传染性强，存在于细胞外，多在疾病早期的活动性病灶和空洞内，容易被抗结核药物所杀灭，异烟肼效果最好，起主要杀菌作用，链霉素及利福平亦有效。 B群：缓慢繁殖菌，存在于干酪坏死灶内，结核杆菌常呈休眠状态，偶尔发生短暂的生长繁殖，仅对少数药物如利福平敏感。 C群：间断繁殖菌，存在于巨噬细胞内，细菌得到酸性细胞质的保护，但繁殖缓慢。吡嗪酰胺在pH<5.5时，杀菌效果较好。 B群与C群为顽固菌，可存活数月、数年，亦称“持续存活菌”， 是日后复发的根源。 D群：完全休眠菌，病灶内有少量结核杆菌完全处于休眠状态，无致病力及传染性，药物对其无作用。 结核病化疗的目标是杀灭结核杆菌，使病灶痊愈。抗结核药物的治疗目的是快速杀灭病灶内的大量快速生长A群菌，以及缓慢和间歇繁殖的B、C菌群，已达到治愈并减少复发。

8 结核病化疗 抗结核药物的治疗目的是快速杀灭病灶内的大量快速生长A群菌，以及缓慢和间歇繁殖的B、C菌群，已达到治愈。结核病化疗应该是高效杀菌，低不良反应。 INH对A群结核杆菌有抑制和杀灭作用； A、B、C菌群对RFP高度敏感，均有杀菌作用，是治疗结核病标志性药物；SM对细胞外结核杆菌（A）有杀菌或抑制作用；PZA仅对细胞内（C)有杀菌作用；EMB对细胞内外有相仿的抑制作用。

9 体积相同性质不同病灶与含菌量 肺结核的传染性决定病人痰中结核菌的数量和病人的咳嗽症状。涂阳病人排菌量大，是主要传染源，涂阴培阳病人传染性小。
体积相同性质不同病灶与含菌量 肺结核的传染性决定病人痰中结核菌的数量和病人的咳嗽症状。涂阳病人排菌量大，是主要传染源，涂阴培阳病人传染性小。 直径 2cm的空洞含菌数108-9 直径 2cm的干酪病灶菌量约105-6 直径 2cm的结节病灶或闭合干酪灶102-3 肺结核的传染性决定病人痰中结核菌的数量和病人的咳嗽症。状涂阳病人排菌量大，是主要传染源，涂阴培阳病人传染性小。

10 化疗前后结核杆菌的定量分析 对痰菌阳性病人在化疗前后做结核杆菌培养的定量分析 化疗前每ml细菌数106(1000000/ml-4+）
高效、低不良反应的化疗方案，结核杆菌数量会迅速减少，2W可减少90%，4W可减少99%，传染性显著下降。

11 二.结核病实验室诊断方法 细菌学检查－涂片、培养、药敏 免疫学检查－皮试、结核抗体

12 痰涂片检查的意义 目前，控制结核病流行以发现和控制传染源为主。我国优先控制痰涂片阳性肺结核。 2、评价传染性肺结核的化疗效果
1、发现传染性肺结核的主要方法 目前，控制结核病流行以发现和控制传染源为主。我国优先控制痰涂片阳性肺结核。 2、评价传染性肺结核的化疗效果 抗结核药物的化疗机理是杀灭病灶中结核杆菌，评价结核病的化疗效果，必须以抗酸杆菌检查结果作为依据。 3、为结核病疫情的流行病学统计服务 传染性结核病在流行病学中有特殊的意义，在反映一个国家或地区结核病疫情的严重程度的指标中，涂阳患病率等被更多关注。 肺结核病人发现方式：因症求诊、可疑者线索调查、重点人群检查和普查。 初诊的肺结核可疑症状者要进行3次痰涂片检查，以提高阳性率，强化期末和疗程结束前均应查2次痰涂片，儿童可抽取胃液或呕吐物检查。

13 痰标本的含菌量与痰涂片阳性检出率的关系 标本菌量(个/ml) 镜检可检出菌量数(个) 检出阳性结果的几率(%) <1000 0/100或更多视野 5000~10000 1~8/300视野 50.0（报告实数） 30000 3~9/100视野 80.0（1+） 50000 1~9/10视野 90.0（2+） 100000 1~9/每视野 96.2（3+） 500000 > 10 /每视野 99.9（4+） ml,2.0*2.5cm,2万个视野，300个视野，5分钟。 查痰宣教，告知病人。 初诊的肺结核可疑症状者要进行3次痰涂片检查，强化期末和疗程结束前均应查2次痰涂片。查痰宣教，告知病人。

14 涂片检查法 优点： 适用于痰、尿、便、体液、组织等几乎一切标本，有重要的临床诊断价值；
是发现和确定传染源的主要方法，是考核和评价疗效的重要指标，有重要的流行病学意义； 操作简便、快速，成本低廉，适于各级实验室开展； 约10-20肺结核病人痰涂片阳性。 缺点： 敏感性低：每毫升含 条以上抗酸菌才可得到阳性结果； 特异性较低：只能报告“抗酸杆菌阳性”，不能区分结核和非结核分支杆菌； 镜下只能观察菌体形态，不能辨别死、活菌。

15 痰涂片显微镜检查流程 结果记录 标本收集 及保存 TB 可疑者 TB 病人 标本接收和登记 材料准备 涂片 结果报告 标本/污染物
的安全丢弃 染色 只有做好流程的每个环节，就能够提供准确可信的试验结果，避免出现假阳性、假阴性。按照要求登记报告、保存痰片。 做好每个环节并不难，只要按照要求认真去做。 上级实验室督导不会有问题。 涂片保存 用于EQA 显微镜检 痰涂片显微镜检查流程

16 查痰对象 结核病可疑者 少量查痰代胸片的受检者 咳嗽、咳痰超过2周 咳血或伴有血痰 发热或胸痛超过2周 胸部X线异常
根据《中国结核病防治规划实施工作指南》的规定，检查对象根据检查目的分为两类：确诊诊断（发现传染源）、疗效评价（作为确定化疗方案和治疗效果评价的指标） 确诊诊断：凡因结核病症状求诊及转诊的可疑肺结核患者，查3个痰。 疗效评价：凡因确诊、登记、治疗的肺结核患者，在化疗期间按照规定应定期查痰，查2个痰。

17 痰标本收集 容器：广口、螺旋盖、可密闭、不易泄漏 标本性状：干酪痰、血痰、粘液痰、唾液 采集时间：即时痰、晨痰、夜间痰
使用统一的塑料螺旋盖痰盒，不要用蜡纸盒。 留取3~5ml，干酪痰、褐色血痰、少量新鲜血液的血痰、黏液痰液为合格标本。 标本性状应该记录在实验室登记本上，有的单位不合格痰液比例较大，有的标本连续一致。 非结核病可疑症状者不需查痰。

18 痰标本采集宣教 指导病人： 可能需要反复尝试，才能留取一份理想的痰标本 深吸气2-3次，每次用力呼出 从肺部深处咳出
将打开盖的痰盒靠近嘴边收集痰液 拧紧盒盖 可能需要反复尝试，才能留取一份理想的痰标本

19 只有高质量的痰液才能有准确可信的抗酸菌结果

20 涂片  编号  涂抹痰标本  自然干燥 三个步骤（zhou），编号-制片-干燥（zao）

21 载玻片： 一张载玻片上只能涂抹一份痰标本。 每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于抗酸杆菌涂片检查。
应使用95 %乙醇擦拭或浸泡脱脂，用干燥、清洁、无划痕的新载玻片涂片，在玻片背面左侧1/3处注明实验序号及标本序号（如载玻片有磨砂面，可用2B铅笔书写编号。如载玻片没有磨砂面，必须用玻璃笔(或腊笔)书写编号。

22 显微镜检查 1.接通电源，打开开关 上升聚光镜至最高，调节光圈70－80％大小 2.将涂片放在载物台上，痰膜朝上
在油镜下，至少检查300个有用的和有代表性的视野（至少5分钟） 使用10倍目镜双目显微镜读片；痰膜向上防治在载物台上并以卡尺固定；使用40倍物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态；移开40倍物镜，在玻片上滴1`2滴高级油镜油，使用100倍物镜进行细致观察，避免镜头接触痰膜； 镜头清晰，无霉菌生长。油镜下视野背景清晰

23 8、结果报告 阴性 未发现抗酸菌/ 300 视野 报告实际菌数 1-8 条 /300 视野 阳性1＋ 1-9 条 / 100 视野 阳性2＋
1-9 条 / 10 视野 阳性3＋ 1-9 条 / 每视野 阳性4＋ 达到或超过 10 条 /每视野 仔细观察300个视野需要5分钟以上。 报告1+时至少观察300个视野，报告2+至少观察100个视野，3+、4+时至少观察50个视野。否则会有量化误差 一位镜检人员连续读片10～12张应休息20分钟。

24 结果按规定记录在结核病细菌学实验室登记本和化验单上，报告痰涂片结果应注明痰标本的性状。
阴性结果应观察300视野，观察时间不少于5分钟。阴性结果应填写“阴性”，不得以“—”表达。

25 分支杆菌分离培养意义 1、在结核病诊断上具有重要意义，是目前结核病诊断的“黄金标准”; 2、提高阳性率,使少数细菌也能长出来;
3、进一步进行药敏试验、菌型鉴定、DNA分析等。 培养的主要方法有：1、传统的改良罗氏培养基，需4-8W才能报告结果；2、快速液体培养，5-7天报告结果，可做药敏。 什么情况下要做培养：1.涂阴要做鉴别诊断时，培养阳性可确诊为肺结核；2.抗结核治疗失败，要做培养进行菌型鉴定和药敏试验。 目前，培养的主要方法有：1、传统的改良罗氏培养基，需4-8W才能报告结果；2、快速液体培养，5-7天报告结果，可做药敏。 尽管结核杆菌不是作为传染源诊断的主要方法，但结果可信度高，是金标准，能做鉴定、药敏和分子检查。 什么情况下要做培养：1.涂阴要做鉴别诊断时，培养阳性可确诊为肺结核；2.抗结核治疗失败，要做培养进行菌型鉴定和药敏试验；

26 常规培养（罗氏培养基） 灵敏度高于涂片法； 可以鉴定死菌与活菌； 可进一步进行菌种鉴定和药敏试验 缺点： 需时长久，4—8周；
优点： 灵敏度高于涂片法； 可以鉴定死菌与活菌； 可进一步进行菌种鉴定和药敏试验 缺点： 需时长久，4—8周； 阳性率偏低，约30-40%； 无法鉴定结核与非结核分支杆菌。 被誉为诊断结核病的“黄金标准”

27 培养操作方法 标本前处理 目的：液化标本、去除杂菌、分离出分枝杆菌 原理：分枝杆菌对酸碱有相对强的耐受力
原则： 尽可能杀灭标本中的杂菌， 尽可能保存标本中的分枝杆菌 步骤： 取1－2ml痰标本至前处理管 视标本性状加入1－2倍体积的4％氢氧化钠 震荡30－60秒至标本完全液化 室温静置15分钟（整个处理时间不得超过20分钟）

28 培养操作方法 接种 用无菌吸管取前处理后的标本 接种0.1ml至酸性罗氏培养基斜面 尽量使菌液均匀铺满斜面 每份标本接种2支培养基

29 培养操作方法 结果的观察与报告 接种后第3、7天各观察一次菌落生长情况 此后每周观察一次，直至满8周，每次观察记录菌落生长及污染情况
分枝杆菌培养阴性： 斜面无菌落生长 分枝杆菌培养阳性（1+）： 菌落生长占斜面面积的1/4 分枝杆菌培养阳性（2+）： 菌落生长占斜面面积的1/2 分枝杆菌培养阳性（3+）： 菌落生长占斜面面积的3/4 分枝杆菌培养阳性（4+）： 菌落生长布满整个斜面 菌落生长不足斜面面积1/4者，报实际菌落数。

30 结核分枝杆菌耐药性测定（常规） 我国是27个耐药结核病高负担国家之一，当前耐药结核病诊断主要依据DST，DST对有效化疗方案的建立和预后的预测具有重要意义。 方法：结核杆菌耐药性测定的方法有绝对浓度法、比例法、仪器快速法和耐药基因检测法等。 意义： 指导用药：化疗前药敏—选择用药;疗效不佳时药敏—观察有无耐药性、调整用药。 监测社会中耐药结核菌株的流行情况 评价和改进国家结核病控制措施的重要参考因素之一。 我国是27个耐药结核病高负担国家之一，当前耐药结核病诊断主要依据DST，DST对有效化疗方案的建立和预后的预测具有重要意义，但有时DST与临床观察存在不一致性。

31 耐药结核病相关定义 判断耐药结核病需要通过体外药敏试验证实结核杆菌是否耐药。 单耐药：对一种一线抗结核药物耐药。
多耐药：对一种以上的一线抗结核药物耐药。 耐多药（MDR－TB）：至少同时对INH和RFP耐药。 严重耐多药（XDR－TB）：至少同时对INH和RFP耐药外，还对任何氟喹诺酮类抗生素（如：氧氟沙星）产生耐药，以及三种二线抗结核注射药物（如：卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素等）中的至少一种耐药。

32 耐药结核病疫情现状 来自于 年全国结核病耐药性基线调查： 1. 从涂阳肺结核病患者分离的结核分枝杆菌总耐药率为37.79%，其中初治肺结核总耐药率35.16%、复治肺结核总耐药率55.17%。 2. 从涂阳肺结核病患者分离的结核分枝杆菌总耐多药（MDR-TB ）率为8.32%，其中初治肺结核总耐多药率5.71%，复治肺结核总耐多药率25.64%， 3.总广泛耐药（XDR-TB）率为0.68%，其中初治患者为0.47%，复治患者为2.06%。

33 耐药结核病疫情现状 4. 根据此次调查结果估算，我国每年新发耐多药肺结核患者约12万例，其中广泛耐药肺结核患者近1万例。
5. 耐多药肺结核患者分布以农村为主，青壮年患者比例较高，耐药结核病的性别分布没有统计学差异。 6. 不规范抗结核治疗及患者依从性差是耐药性产生的主要危险因素。

34 免疫学检查 1、细胞免疫学诊断--结核菌素试验
是常用的诊断与辅助诊断方法，其原理为IV型超敏反应。临床意义:(1)为接种卡介苗提供依据 ；(2)为测定免疫效果提供依据 ；(3)用于诊断与鉴别诊断。 2 、体液免疫学诊断（血清学诊断）     是检测结核抗体，细胞免疫随者病情的加重而减弱，体液免疫随着病变的加重（或血行播散）而增加，这种细胞免疫与体液免疫分离的现象在结核病方面表现非常明显。 临床意义：活动性肺结核的诊断与鉴别诊断；各种肺外结核的诊断与鉴别诊断；器官移植并发结核感染的诊断。 已细胞免疫为主，与其他感染性疾病一样，产生IgG、M;假阴性-抗原未包被、抗体滴度低、抗原抗体复合物；假阳性-BCG、隐形感染、交叉抗原。

35 三.结核病实验室新诊断工具 （一）细菌学诊断技术 （二）免疫学诊断技术 （三）分子诊断技术

36 （一）细菌学诊断新技术 1、快速培养基 液体培养基—米氏7H9液体培养基 双相培养基—同时含有液体培养基 变色培养基—固体、液体培养基
2、快速检测方法 噬菌体法检测技术 液体培养结合显微镜观察技术

37 1、快速培养基-液体培养基 米氏7H9液体培养基（肉汤基础） 营养丰富：油酸、白蛋白、葡萄糖、过氧化氢酶等
细菌可获得充足的养料：营养添加剂对于许多分枝杆菌生长至关重要 抑制污染：添加PANTA抑菌剂（多粘菌素B、两性霉素B、萘啶酸、甲氧苄氨嘧啶、阿洛西林）

38 BACTE MGIT 960 System全自动分枝杆菌检测系统 BacT-ALERT3D全自动快速微生物/分枝杆菌培养侦测系统
全自动分枝杆菌检测系统（液体培养基） BACTE MGIT 960 System全自动分枝杆菌检测系统 BacT-ALERT3D全自动快速微生物/分枝杆菌培养侦测系统 20世纪70年代诞生的分枝杆菌快速培养和药敏检测技术，以BACTEC460为第一代检测系统，后期有了960和3D。

39 BACTEC MGIT 960 System全自动分枝杆菌检测系统
先进灵敏的检测技术 性能优异--高检出率、低检出时间 安全可靠--工作人员得到最佳保护 大容量： 960个培养管/台，操作简单 完善的培养、鉴定和药敏实验解决方案 高性能价格比国际市场上唯一的专业分枝杆菌培养、鉴定和药敏实验系统

40 Bactec MGIT 960的基本原理是其所使用的培养瓶底部含有包被于树脂上的荧光显示剂，由于该显示剂为氧抑制性，当分支杆菌生长使氧消耗后，荧光显示剂被激活，而发出荧光。检测系统每隔60分钟连续测定培养管内荧光强度，从而判断管内分枝杆菌生长情况。 该培养仪可用于痰、支气管盥洗液、胸水、腹水、脑脊液、尿液、脓液、关节液、病灶组织或干酪块各种临床标本的分枝杆菌培养、初步菌种鉴定和药物敏感试验。 结果表明：Bactec MGIT 960与Bactec TB 460、L-J三种方法的阳性率分别为80%、85%和71%，本平均报告时间为分别为13.3天、14.8天和25.7天。

41 全自动快速微生物/分枝杆菌培养侦测系统 —可同时处理血液、体液的待检标本 3D-240型血液、结核分枝杆菌培养仪
可同时进行血培养、无菌体液微生物培养及快速结核杆菌培养。

42 BacTALERT3D检测原理：产色检测技术
细菌生化代谢 细菌生长产生 CO2 CO2 降低 pH 值 颜色感应器转为黄色 培养瓶底的颜色感应器 含有溶解染料的硅胶 不可逆颜色改变 黄色  阳性培养 BacT ALERT 3D 培养系统检测原理是其所用的培养瓶底部有顏色感应器，当分枝杆菌在培养瓶中生长，有C02产生时，顏色感应器由绿色变成黄色。仪器自动连续检测，检测的数据输入计算机，根据计算结果自动显示培养瓶中有无分支杆菌生长。结果3D系统 和常规培养法检测分支杆菌平均报告时间分别为11.7天、1和26.8天；其中涂阳标本平均时间为11天和29天，涂阴标本平均为21天和36天。 结果3D系统 和常规培养法检测分支杆菌平均报告时间分别为11.7天和26.8天。

43 液体培养基 缺点 优点 培养时间短（8~14天） 阳性率高（比L-J增加15~20%） 可做药敏试验 （仪器5~7天） 不能观察菌落特征
费用较贵

44 分枝杆菌快速培养和耐药性测定 分枝杆菌快速耐药性测定主要有BACTEC460、BACTEC960、 BacT/ALERT 3D 系统，标本的前处理方法和接种方法基本一致，但检测原理不同。

45 分枝杆菌快速耐药性测定 阳性培养管取出后直接涂片进行抗酸染色以确定是否为AFB。
用阳性培养管制备菌悬液，接种于含有抗结核药物的培养管中，然后置培养仪中进行培养，根据分枝杆菌的生长情况而判断该药物敏感性。 分枝杆菌快速培养检出时间平均≦10天； 快速药敏检出时间平均≦5天 药敏试验检测包括RFP、SM、EMB、INH、PZA，同时用户可进行自定义药敏试验

46 2.免疫学诊断新技术 (1)结核蛋白芯片 (2)特异性T细胞检测 —酶联免疫斑点试验（T-SPOT）

47 (1)结核蛋白芯片 蛋白芯片始创于90年代初，又称DNA芯片。
其原理是将结核杆菌多种特异性蛋白抗原（16KDa、38KDa、LAM）固定在固相载体上，然后与待测样本的抗体结合，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品中抗体分子的数量和序列信息。 该方法同时将大量蛋白抗原固定于支持物上，所以一次可以检测多种抗体等信号。 基因芯片技术也可应用于结核杆菌的基因分型与菌种鉴定、耐药性测定。

48 结核蛋白芯片可以检测结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）抗体，结核分枝杆菌蛋白16-KDa抗体和38-KDa抗体三种。
蛋白芯片法检测结核抗体 结核蛋白芯片可以检测结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）抗体，结核分枝杆菌蛋白16-KDa抗体和38-KDa抗体三种。 临床意义 （1）鉴别痰涂片阳性者是否属于结核杆菌感染。 （2）提高痰涂片阴性患者的检出率。 （3）肺外结核的检测。

49 结核蛋白芯片检测结核抗体的灵敏度38.5%，特异度96.5%。
不同类型结核病阳性率：培养阳性结核病61.2%、培养阴性结核病45.7%、结脑29.9%、结核性胸膜炎23.3%、骨结核27.3%。 结核蛋白芯片诊断结核病是较有效的方法之一，具有较好的特异性和快速诊断等优点。

50 (2)特异性T细胞检测 酶联免疫斑点试验（ T-SPOT）
原理：结核菌感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（ IFN-γ），通过高灵敏度的酶免法使IFN-γ滞留在微孔板表面，显色底物在反应部位被酶分解成沉淀的色素斑点。每一个斑点代表一个γ干扰素分泌细胞，从而对结核杆菌感染进行辅助诊断。又称γ干扰素释放试验。 检测用的抗原：ESAT-6和CFP-10 ESAT-6和CFP-10二种蛋白只存在于结核分枝杆菌中。

51 潜伏性结核的诊断和治疗 大量的潜伏性结核感染者是新发结核病患者的主要来源，潜伏感染的人群数量非常庞大，因此，我们必须通过努力鉴别并治疗这些潜伏期的结核感染者。 以前潜伏感染主要依赖于皮肤试验诊断，该试验特异性低，与BCG和其他分枝杆菌感染有交叉；灵敏度低，活动性结核病中灵敏度75~90%，特别在播散性结核病和免疫功能低下更低。

52 临床意义及应用价值 阳性结果：说明患者体内存在针对结核杆菌的效应T淋巴细胞。 阴性结果：说明患者体内不含有针对结核杆菌的效应T淋巴细胞。
活动性结核病的诊断 结核潜伏感染者的诊断 HIV合并结核感染的检测 区别结核感染者与BCG接种者

53 ELISPOT技术优点 ELISPOT技术缺点 特异性好：只针对结核分枝杆菌，对绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗无交叉反应。
灵敏度高：基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率，快速简便。 ELISPOT技术缺点 缺点是操作繁琐， 需特殊仪器设备 试剂费用昂贵

54 结核病实验室新诊断工具 世界卫生组织建议使用 分子生物学方法来检测耐多药结核病

55 结核分枝杆菌复合群耐药基因 分枝杆菌复合群中的耐药基因 55 分子线性探针技术
采用线性探针技术（Line-Probe或称DNA-Strip）检测结核分枝杆菌复合群利福平(rpoB)和异烟肼(katG和inhA)耐药基因 检测rpoB基因的常见突变位置 (coding for the α-subunit of the RNA polymerase)来判断利福平耐药性 检测KatG基因(coding for the catalase peroxidase)及inhA基因(coding for the NADH enoyl ACP reductase)来判断异烟肼耐药性 编码结核分枝杆菌RNA聚合酶β亚单位 利福平：rpoB基因 利福平耐药的90~95%由该基因突变引起 集中于509~533的利福平耐药决定区 531位、526位、516位、513位、533位 常见突变位点及频率从高至低依次为： GenoType® MTBDRplus检测： 2.耐药突变位点: 531、526A、526B、516 1.野生型位点: WT1~WT8 异烟肼：katG和inhA基因 40-100%异烟肼耐药是由该基因突变引起且为高水平耐药 katG基因：编码触酶-过氧化物酶 25%异烟肼耐药是由该基因突变引起且为低水平耐药 inhA基因：编码NADH烯酰基ACP还原酶 1个野生型位点： katG基因： 2个耐药突变位点： 4个耐药突变位点： 2个野生型位点： inhA基因: Hian 检测步骤 固体或液体培养基培养的菌种 标本 DNA提取 超声波裂解： 方法 抗酸染色涂片阳性标本 GenoLyse试剂盒： 1.不同标本,扩增参数不同 PCR扩增 培养菌种：扩增20个循环 3.多重PCR扩增 2.引物：生物素标记 涂阳标本：扩增30个循环 杂 交 PCR扩增产物→变性（DNA成单链）→与线性探针杂交→洗涤→显色→判断结果 采用反向杂交法 扩增产物-探针杂交 解链 - ssDNA 杂交试剂 DNA-strip显色 严格漂洗 GenoType® MTBDRplus的反应区 结果判读 野生型：有杂交带显色为¡°+¡±，表示未发生突变 耐药突变位点：有杂交带显色为¡°+¡±，表示发生突变 敏感：所有野生型探针“+”和所有耐药位点探针“—” 耐药：对应药物有1条野生型探针“—”或有1条耐药位点“+” 山东胸科医院11月2日培训结果 分子线性探针未能完全取代传统培养，特别是涂阴标本必须做培养，但这个新技术缩短了等候的时间及省略了繁琐的操作。 WHO在南非、印度及俄罗斯这些TB高发区，展示分子线性探针跟传统培养对比，涂阳标本的灵敏度和特异性高于97%和98%，肯定了分子线性探针技术快速检测高度可疑MDR-TB病人的价值。 55

56 利福平：rpoB基因 通常检测rpoB基因的常见突变位置 (coding for the α-subunit of the RNA polymerase)来判断利福平耐药性 rpoB基因是编码结核分枝杆菌RNA聚合酶β亚单位， 90~95%的利福平耐药由该基因突变引起，主要集中于509~533的利福平耐药决定区，为高水平耐药。

57 利福平：rpoB基因 rpoB基因的常见突变位点及频率从高至低依次为：531位、526位、516位、513位、533位。
GenoType® MTBDRplus检测：耐药突变位点 531、526A、526B、516

58 检测原理 异烟肼：katG和inhA基因 检测KatG基因(coding for the catalase peroxidase)及inhA基因(coding for the NADH enoyl ACP reductase)来判断异烟肼耐药性； katG基因：编码触酶-过氧化物酶， %异烟肼耐药是由该基因突变引起且为高水平耐药。 inhA基因：编码NADH（还原型辅酶Ⅰ）烯酰基ACP还原酶，25%异烟肼耐药是由该基因突变引起且为低水平耐药。 GenoType® MTBDRplus检测：katG基因有2个耐药突变位点；inhA基因有4个耐药突变位点。

59 三、耐多药结核病新诊断工具 （二）耐多药结核病新诊断工具 —分子生物学诊断技术
1、基因芯片（Gene chip）：诊断结核感染及对异烟肼和利福平的药物敏感性 2、线性探针杂交（Hain LPA）：诊断结核感染及对异烟肼和利福平的药物敏感性 3、实时PCR技术（Gene Xpert）：诊断结核感染及对异烟肼和利福平的药物敏感性 4、DNA测序：诊断异烟肼和利福平的药物敏感性 59

60 1.基因芯片 结核分枝杆菌耐药检测基因芯片是基于结核分枝杆菌rpoB/katG/inhA（利福平、异烟肼）的基因位点突变与耐药性相关，通过PCR扩增和核酸杂交，检测荧光信号的有无，判断特定位点突变情况的耐药性检测方法。 样品制备仪 杂交仪 激光共焦扫描仪 软件判读 获国家医疗器械证书和欧盟CE认证 60 60 60

61 1.基因芯片 基因芯片始创于90年代初，是近年来发展起来的进行大规模遗传多态性检测的新方法。
基因芯片测定耐药性的主要步骤为：1)制备测定耐药性的基因芯片；2) 获得待测样品DNA并进行PCR扩增和标记；3)扩增产物与芯片探针进行杂交、显色；4)扫描检测、数据处理、结果判定。 目前，基因芯片技术已在结核分枝杆菌的基因分型与菌种鉴定、耐药性测定及基因组比较分析研究中得以应用，其中尤以耐药性测定最为引人关注。

62 1.基因芯片 杂交反应 生化反应 清洗干燥 扫描检测 数据分析 检测分析 PCR扩增 DNA 提取 样品制备 62

63 1.基因芯片 应用：耐多药结核病筛查，国内在4个省的4个地市级评估。 敏感性（%） 特异性（%） RFP 82 97 INH 81 95
MDR 73 63

64 1.基因芯片 标本：涂阳痰标本、培养阳性菌株 时间：约8小时 注册：通过国内SFDA注册 64

65 2.线性探针耐多药结核病检测技术 Hain-MTBDRplus
原理：是多重PCR，用4对引物包括16S鉴定、 rpoB、katG和inhA 基因进行PCR扩增，PCR扩增后的产物与预先固化在膜上的27条野生和突变特异性探针杂交，检测rpoB、katG和inhA基因突变位点,诊断利福平和异烟肼耐药性及分型。  在核酸探针基础上发展起来的线性探针杂交技术（LiPA）已应用于耐药基因突变的检测。有报道RFP耐药菌的敏感性为94.4％，与药敏结果的符合率为96.4％。本法快速、简便，有一定的实用价值。缺点是价格太贵。 核酸探针     核酸探针(nuclear acid Probe)是一项很有前途的检测技术。它可以鉴定不同种群的分支杆菌，有助于肺结核的诊断和鉴别诊断。分支杆菌的核酸探针有四种主要类型：cDNA或rRNA探针，全染色体DNA探针，克隆的DNA或PCR扩增片段探针及寡核甘酸探针等。其显著优点是特异性强。缺点是直接检测临床标本的敏感性较低，一般标本中含1×l04／ml细菌才能呈现阳性反应。因此，核酸探针很少用于临床诊断。文献报道其对结核病的阳性检出率约在40％-60％，而且影响因素较多。目前，不少学者正在探索如将特异性强的DNA探针与敏感性高的PCR技术相结合，则有可能成为结核病研究与临床应用的一种良好方法。如有学者将PCR与反向探针杂交技术相结合，建立了结核与非结核分枝杆菌的菌种鉴定技术。结果表明其检测灵敏度为100fg，并可准确鉴定出受试的25株分支杆菌标准株和11种非分枝杆菌。将其用于临床标本检测，26份抗酸阳性痰标本全部鉴定为结核分枝杆菌复合体。     在核酸探针基础上发展起来的线性探针杂交技术（LiPA）以被用于耐药基因突变的检测。报道较多的是在利福平rpoB基因突变检测中的应用。有报道LiPA检测RFP耐药菌的敏感性为94.4％，与药敏结果的符合率为96.4％。本法快速、简便，有一定的实用价值。缺点是价格太贵。 65 65

66 2.线性探针耐多药结核病检测技术 3) 杂交 DNA提取 2) PCR扩增 4) 结果判读 扩增产物和 固化在 膜上的特异性探针杂交
用NALC/NaOH 处理痰标本 2) PCR扩增 4) 结果判读 66 66

67 Hian 检测步骤 涂阳样本 （需先经消化处理） 培养物 （来自固体/液体培养基） DNA提取 0.5 h PCR扩增 2.5~3h
探针杂交 结果判读 所需时间

68 2.线性探针耐多药结核病检测技术 标本：培养阳性菌株、涂阳痰标本。 时间：较短（8小时），操作简单。 注册：试剂通过SFDA注册
条件：实验室通过临床基因扩增实验室认证 68

69 2.线性探针耐多药结核病检测技术 应用：耐多药结核病筛查，国内在4省的4个地市级评估。 94 97 82 98 80 99 敏感性（%）
特异性（%） 利福平 94 97 异烟肼 82 98 耐多药结核 80 99 69

70 3.实时荧光定量核酸扩增耐多药结核病检测技术（GeneXpert）
原理： GeneXpert系统由美国研发，完全整合了传统PCR检测所需的三个步骤，具有集成性、快捷性、灵活性、易操作、安全性和精确性，可快速检测rpoB、katG和inhA基因突变位点,诊断利福平和异烟肼耐药，鉴定是否结核。 核酸提取0.5小时，耐药检测时间2小时。 灵敏度95%，特异性95%。 注册：设备通过国内SFDA注册 70

71 3.实时PCR 技术 安全性：直接用痰标本，密闭体系中反应，生物安全性好。 71

72 3.实时PCR 技术 简便性：标本制备、扩增、检测一体自动化。 72

73 3.实时PCR 技术 时间：2小时检测是否结核杆菌和利福平耐药。 73

74 4.DNA序列测定 PCR 扩增 扩增片段与标准DNA片段比对 找到基因突变位置 寻找基因突变金标准 74 DNA序列测定
    DNA序列测定不仅能够用于突变的检测，而且能够确定突变的部位与性质，因此是检测基因突变的最理想方法，也是判断突变的金标准。DNA序列测定有多种方法，但PCR—DNA序列测定简便、快速，是最常用的测定方法。目前，DNA序列测定技术已在结核分支杆菌耐药基因研究中得到广泛应用。并已用于rpoB、inhA、 katG、rpsL和gyrA基因突变检测。如Frank等对INH耐药株进行DNA序列测定分析，发现在KatG基因中，尤以第463位点上精氨酸→亮氨酸的突变及第315位点上丝氨酸→苏氨酸的突变最为常见。Telenti等的研究发现所有rpoB基因突变都集中在一个23个氨基酸的区域内。突变频率最高的是在氨基酸密码子531位（丝氨酸→亮氨酸）上，次之为526位（组氨酸→酪氨酸）。国内一些研究也证明了上述突变。有报道对212株MTB包括rpoB基因核心区域81个碱基在内的588个碱基进行序列测定，结果有89．0％(145／163)的耐药株存在rpoB基因突变，而对照敏感株均无突变。     尽管DNA序列测定能够准测定突变的部位与性质，但对每一株菌株来说，要测定各种抗结核药物所有已知的突变部位需多次反应，费用昂贵；同时测序仪价格昂贵，难以在常规实验室普及，因此使其应用受到一定限制。故DNA序列测定多作为评价其他方法的参考方法或与其他方法结合应用。但近年来随着PCR产物直接测序等新技术的出现，DNA测序技术的自动化、规模化、商品化，以及成本的降低，为今后分支杆菌基因序列的信息研究以及分支杆菌菌种鉴定提供了便利条件。 74 74

75 4.DNA序列测定 DNA序列测定不仅能够用于突变的检测，而且能够确定突变的部位与性质，因此是检测基因突变的较理想方法，也是判断突变的金标准。 DNA序列测定有多种方法，但PCR—DNA序列测定简便、快速，是最常用的测定方法。目前，DNA序列测定技术已在结核分支杆菌耐药基因研究中得到广泛应用。并已用于rpoB、inhA、 katG、rpsL和gyrA基因突变检测。 尽管DNA序列测定能够准确测定突变的部位与性质，但对每一株菌株来说，要测定各种抗结核药物所有已知的突变部位需多次反应，费用昂贵；同时测序仪价格昂贵，难以在常规实验室普及，应用受到一定限制。

76 新诊断方法（耐药）应用展望 区县痰检室 新诊断技术应用评估 技术支持 国家结核病参比实验室 省级 参比室 地市级实验室 新诊断技术 药敏
耐多药新诊断技术 培养 76

77 耐多药结核病治疗策略 病人为中心治疗体系 省级定点医院 地市级定点医院 诊断和住院治疗 区县 结防机构 社区卫生服务 中心
耐多药结核病可疑者推荐、转送和管理 社区卫生服务 中心 严重MDR和XDR-TB住院治疗；培训和技术支持 病人为中心治疗体系 病人管理 77