重组DNA技术.

Presentation on theme: "重组DNA技术."— Presentation transcript:

1 重组DNA技术

2 生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原因：
（1）二十世纪后叶，分子生物学领域一系列突破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生了革命性的变化； （2）建立在实验室研究基础上的生物技术的发展为人类带来了巨大的利益和财富。 生物技术将是未来经济发展的新动力 第一次技术革命 工业革命 解放人的双手 第二次技术革命 信息技术 扩展人的大脑 第三次技术革命 生物技术 改造生命本身

3 基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。 基因重组技术作为分子生物学最重要、最基本的技术之一，是许多分子生物,生物化学和细胞生物学实验实施的基础。

4 现代基因工程的创始人P·伯格（美国,1926－）在1960年以敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？1972年，伯格把两种病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，首次实现两种不同生物的DNA体外连接，获得了第一批重组DNA分子，这标志着基因工程技术的诞生。伯格因此获得了1980年诺贝尔化学奖。

5 1973年，美国斯坦福大学教授S·科恩和加州大学旧金山分校教授H·W·博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明“杂合质粒”在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。

6 科恩随后以DNA重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。 1977年，吉尔伯特（W·Gilbert）分别将编码胰岛素和干扰素的DNA经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。

7 重组DNA操作一般步骤： （1）获得目的基因； （2）克隆:目的基因与载体连接，形成重组的DNA分子； （3）转化：用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传； （4）筛选：对转化子筛选和鉴定； （5）大量培养：对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。

8

9 “纵向”体系 DNA重组的基本模式 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆）
表（达目的基因） “纵向”体系

10 总体技术路线 分 目的基因 基因载体 切 接 表 转 重组体 筛

11 （2）基因组文库(genomic DNA library) （3）cDNA文库 （4）聚合酶链式反应（PCR）
(分)------目的基因及载体的分离 获得需要的目的基因常用的方法： （1）化学合成 （2）基因组文库(genomic DNA library) （3）cDNA文库 （4）聚合酶链式反应（PCR）

12 化学合成 多肽链的氨基酸顺序 mRNA的碱基排列顺序 化学合成目的基因 相应的基因结构
根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。较短的核酸片段（60-80bp） 多肽链的氨基酸顺序 mRNA的碱基排列顺序 化学合成目的基因 相应的基因结构

13 化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。
化学合成的不足之处在于：（１）要已知基因的核苷酸顺序；（２）基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百ｂｐ的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；（３）价格昂贵。 用途： PCR引物,测序引物,定点突变,核酸杂交探针

14 细胞内总DNA的提取分离与基因组文库的构建
基因组DNA：在真核生物体，基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列。

15 基因组文库 基因组文库是含有某种生物全部基因片断的DNA克隆群体。直接从生物体中提取总DNA，用超声或酶处理，将染色体DNA切割成片断，插入载体，转入受体菌扩增，得到基因组DNA文库，从中调用目的基因；缺点结构基因只含基因组很小一部分，有重复序列，假基因。真核生物基因组有内含子。这些给从基因组克隆目的基因带来困难。

16 cDNA文库的构建 cDNA文库 用细胞总mRNA，制备全套双链cDNA后，建立的基因文库。简称c－DNA文库。 mRNA
反转录酶 cDNA (互补DNA） DNA聚合酶 第二条DNA链 以mRNA为模板，用反转录酶，合成与mRNA互补的cDNA(complementary DNA, cDNA) 片段，插入载体，转入受体菌扩增，得到cDNA文库；

17 比较基因组文库与cDNA文库 构建基因组文库获取目的基因存在的问题—— 费时费事 内含子序列 反转录人工合成互补DNA方法的优势——
不含内含子序列 获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因

18 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）
将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术 PCR(Polymerase chain reaction)--聚合酶链式反应 分子生物学，医学，考古，法医 美国Mullis教授1988年发明了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖

19 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）

20 Polymerase Chain Reaction

21 理想载体的基本条件： 载体DNA的选择 可转移性,为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。
合适的复制位点,为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。 多克隆位点：广泛、特异 选择标志，便于筛选和鉴定 分子较小，可容纳较大的外源DNA

22 种类： 质粒 噬菌体 腺病毒载体 逆转录病毒载体 ……

23 质粒载体的一般结构 存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。 具有自我复制功能。 带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。
经改造后具有多克隆位点。

24

25 “纵向”体系 DNA重组的基本模式 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆）
表（达目的基因） “纵向”体系

26 切------限制性内切酶酶切 限制性内切酶酶切 酶切

27 载体和目的基因的切断 通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。 限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。 由限制酶切断后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。

28 “纵向”体系 DNA重组的基本模式 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆）
表（达目的基因） “纵向”体系

29 接------载体和目的基因的连接 即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。 （一）粘性末端连接法： 当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。 较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。

30 载体DNA与目的基因的连接

31 （二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。

32

33 （三）人工接头连接法： 将人工连接器（linker,即一段人工合成的含有多种限制酶切点的小分子DNA片段,约10~20个核苷酸， ）连接到平末端DNA分子(载体和目的基因)上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。 这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。

34 “纵向”体系 DNA重组的基本模式 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆）
表（达目的基因） “纵向”体系

35 转------重组体的转化 重组体的转化 受体细胞

36 宿主菌或受体细胞 ①原核系统 大肠杆菌 枯草杆菌 ②真核系统 酵母菌酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞

37 原核细胞的转化（细菌转化） 受体细胞的选择 限制缺陷型: 避免修饰和降解 重组缺陷型： 避免重组整合 转化亲和型： 较高的可转化性 遗传互补型： 利于筛选 感染缺陷型： 防止感染

38 感受态细胞（competent cell）
所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理状态。 如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Competent cells)。

39 受体细菌 重组体转入细菌 转化 大肠杆菌细胞 大肠杆菌感受态细胞 得到噬菌斑或单菌落 50-100mmol/L CaCl2 感受态细菌
与重组DNA共同冰浴 而后42℃短暂热刺激 得到噬菌斑或单菌落 50-100mmol/L CaCl2 受体细菌 感受态细菌 重组体转入细菌

40 转化方法 E.coli的电穿孔转化：在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外源DNA进入受体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高2~3个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染。

41 真核细胞的转染 受体细胞系统 永生细胞系 细胞特异性的选择标记 对抗某种药物

42 电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样。
转染方法 电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样。

43 重组体 + 磷酸钙微粒 磷酸钙介导的转染 大颗粒 内吞作用 重组体进入细胞
磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将DNA溶液加入到CaCl2中，然后在强烈震荡下加入由Na2HPO4和NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将DNA包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将DNA导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免DNA被细胞内的核酸酶水解。 重组体 + 磷酸钙微粒 磷酸钙介导的转染 大颗粒 内吞作用 重组体进入细胞

44 基因枪转染法：利用被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基本原理，先将DNA溶液与钨、金等金属微粒一起保温，使DNA吸附在金属微粒表面，随高速的金属微粒直接进入细胞内。

45 脂质体（liposome）介导法：将DNA包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将DNA导入细胞内。
多聚物介导法：利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、DNA混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而进入细胞内。

46 “纵向”体系 DNA重组的基本模式 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆）
表（达目的基因） “纵向”体系

47 重组体克隆的筛选与鉴定 转化后的克隆群体：

48 阳性重组子的筛选与鉴定 1、遗传检测法(根据重组载体的标志作筛选) ------插入失活法 ------α-互补法 2. 限制性酶切法
3. PCR法 4.杂交筛选法 5.免疫学方 法 6. 核苷酸序列测定法

49 遗传检测法 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。

50 对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。

51 如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活
pBR322质粒结构

52 Amp Tet 插入片段 Tet平板 pBR322 Amp平板

53 α-互补法——蓝白筛选 现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和N端１４６个氨基酸偏码区（全长1201氨基酸） 。这个编码区中插入一个多克隆位点。 受体菌是Z基因突变型，只含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当外源基因插入时，在IPTG （异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）诱导下合成β－半乳糖苷酶N端片断,和受体菌的C端片断溶为一体后，可产生蛋白质间的互补，形成有活性的β－半乳糖苷酶,称α互补。 具有α互补的细菌培养在含IPTG及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的培养基上. X-gal本身是无色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此会形成蓝色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入突变失活，则不能产生α互补，因此菌落是白色的。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。 IPTG起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远高于乳糖。

54 α-互补法

55

56 限制性酶切法 经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。

57 DNA Marker 空质粒 加样孔 重组质粒 重组质粒酶切 重组质粒的PCR扩增片段 凝胶电泳检测

58 PCR法 利用的目标引物(例如分离目的基因所使用的引物), 抽提需要筛选的克隆的重组DNA作为模板,

59 杂交筛选法 32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法

60

61 分子杂交 依据：碱基互补配对原则 步骤： ①合成核酸探针（与所需基因互补的核苷酸短链，并用同位素标记） ②升高温度或改变pH使DNA变性 ③分子杂交（常用原位分子杂交）如果基因文库中的一个DNA片段能和探针结合形成双链，这一片段即含有所需基因。

62 免疫化学检测法 滤膜（固定抗体） +

63 DNA序列分析法 ACTGAAGGCT 该方法通常是用在目的基因筛选后最终的鉴定。

64 真核细胞的筛选 新霉素抗性选择系统： 新霉素是原核生物的抗生素，对真核生物没有抑制作用，但新霉素的类似物G418对真核细胞及原核细胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（neo）能在真核细胞中表达并能使G418失活（neo基因编码一个磷酸转移酶），细胞可以生长。

65 真核细胞的筛选标记 P 蛋白质合成 ori Am （-） Neo G418 灭活 新霉素类药物 G418筛选

66 tk- 细胞突变株筛选转染细胞 选择原理： tk(胸苷激酶)基因的筛选：受体细胞必须是相应的tk-，将细胞培养在含HAT（H：黄嘌呤，A：氨甲喋呤，T：胸苷）的培养基中。在A存在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成AMP、TMP及GMP。这三种核苷酸的合成只能有补偿途径合成，必须具有tk基因的存在细胞才可生长。

67 氨基喋呤 (HAT选择) TK- （-） 核酸补救合成（TK酶） 核酸从头合成 TK+ 氨基喋呤筛选法

68 “纵向”体系 DNA重组的基本模式 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆）
表（达目的基因） “纵向”体系

69 “纵向”体系 DNA重组的基本模式 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆）
表（达目的基因） “纵向”体系

70 外源基因在宿主细胞中的表达

71 外源基因在宿主细胞中的表达 重组子 目的基因的mRNA 表达蛋白质 大肠杆菌（ E.coli）受体细胞

72 原核生物基因结构和表达特点 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。
原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。 3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统。 4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。操纵子是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。

73 启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 一般长40-60bp，富含A-T碱基对
5、原核生物中参与转录的基因结构： 启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 具有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT -35区： 终止子（terminator，T）:位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列

74 SD顺序（shine-dalgarno）： AUG上游3-11 bp 长约3-9bp mRNA与16s核糖体亚基间的识别与结合序列
6、与翻译有关的原核细胞结构：——核糖体结合位点 翻译起始密码子AUG 或GUG SD顺序（shine-dalgarno）： AUG上游3-11 bp 长约3-9bp mRNA与16s核糖体亚基间的识别与结合序列

75 人类对大肠杆菌经过长期的研究，对其特性和遗传背景了解得最清楚，大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，人们用大肠杆菌用外源基因的表达工具已有几十年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。

76 设计外源基因在大肠杆菌表达就需要外源基因在大肠杆菌中表达所需要的元件，包括转录起始必需的启动子、翻译起始所必需的核糖体识别序列等；外源基因表达的产物可能会对大肠杆菌有毒害作用，会影响细菌的生存繁殖，所以大多数表达载体都带有诱导性表达所需要的元件，即有操纵子序列以及与之配套的调控基因等；外源基因还应当插入到适合于表达的位置，所以表达载体中要设有适合的多克隆位点；此外还应具备基因克隆筛选的条件，包括在细胞中复制必需的复制起始序列、筛选标志如抗药性基因等。

77 外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：
删除内含子和5’非编码区 外源基因置于强启动子和SD顺序控制下 维持正确开放阅读框架（ORF） mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解

78 原核表达载体(expressing vector)
特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序列 大肠杆菌表达载体：含启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号 启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子 核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列 转录终止序列

79 影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：
启动子 终止子 SD mRNA 多肽链

80 影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：
1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。 启动子最佳作用距离-转录起始点 P 启动子的选择和改造 强启动子 可调控启动子

81 常见原核强启动子： Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导 Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。 Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。 PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。

82 Promoters for E. coli Brown p. 278

83 2. 终止子： 强终止子、二聚体终止子 启动子 终止子 转录过度 影响目的基因的转录和翻译效率 干扰基因载体的复制等生物学功能
增加受体细胞的无效能量消耗

84 3. SD序列：影响翻译效率 mRNA SD SD序列与16SrRNA的互补性 SD的后续序列的核苷酸组成 SD与起始密码之间的距离

85 分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙
原核表达载体的类型 融合型表达载体：----融合蛋白 非融合型表达载体：---天然完整蛋白 分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙

86 融合型表达载体 Foreign DNA P SD 融合型表达载体 融合基因

87 融合型载体----pGEX系列 Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物切割方便： pGEX-1T—凝血酶
pGEX-3T---X因子 位相载体

88 优点： 表达效率高 产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定 易纯化：利用融合原核多肽的特性

89 非融合型表达载体 Foreign DNA P SD 非融合型表达载体 非融合基因

90 主要元件：强启动子 SD： ATG：第一个密码子

91 非融合型表达载体----pPL-Lamda
插入位点--HpaI

92 分泌型表达载体： 1、主要元件： 启动子和SD序列 信号肽序列 ：SD下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。

93 分泌型表达载体----pINIII-ompA1

94 ①没有真核转录后加工的功能，不能进行mRNA的剪接，所以只能表达cDNA而不能表达真核的基因组基因；
原核表达系统的缺点 ①没有真核转录后加工的功能，不能进行mRNA的剪接，所以只能表达cDNA而不能表达真核的基因组基因； ②没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性； ③表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体（inclusion body），尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量10%时，就很容易形成包涵体。生成包涵体的原因可能有是蛋白质合成速度太快，多肽链相互缠绕，缺乏使多肽链正确折叠的因素，导致疏水基因外露等。细菌裂解后，包涵体的离心后的沉淀中，虽然有利于目的蛋白的初步纯化，但无生物活性的不溶性蛋白，要经过复性（renaturation），使其重新散开、重新折叠成具有天然蛋白构象和良好生物活性的蛋白质，常常是一件很困难的事情。也可以设计载体使大肠杆菌分泌表达出可溶性目的蛋白，但表达量往往不高。

95 真核表达系统的必要性及优势 1. 具转录后加工系统 2. 具翻译后修饰系统 3. 可实现真正的分泌表达 4. 基因治疗

96 真核基因组庞大，具大量非编码序列 ---mRNA丰度不同
真核基因结构及表达调控特点 真核基因组的复杂性 真核基因组庞大，具大量非编码序列 ---mRNA丰度不同 结构复杂：染色质、核膜、线粒体---表达调控多样 不连续性：内含子、外显子 没有操纵子结构

97 据受体细胞及表达载体的不同分为3种： 酵母表达系统 哺乳动物细胞表达系统 昆虫细胞表达系统

98 要表达真核生物的蛋白质，采用真核表达系统自然应比原核系统优越。真核表达载体至少要含两类序列：①原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。 ②在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。

99 真核表达载体 真核表达元件： 启动子/增强子 克隆位点 终止信号和加poly(A)信号 剪接识别信号 复制与选择元件

100 外源基因的表达 1、胞内表达 2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列 缺点：操作技术难、费时、不经济

101 基因载体 目的基因 有切口的载体 有切口的目的基因 带重组体的宿主细胞 目的基因的表达 质粒 噬菌体 病毒 限制性内切酶 DNA连接酶
质粒 噬菌体 病毒 PCR cDNA 化学合成 基因组文库 限制性内切酶 有切口的载体 有切口的目的基因 DNA连接酶 重组体 转化 转染 体外包装 带重组体的宿主细胞 表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法 目的基因的表达