遗传学实验 粗糙链孢霉的杂交.

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1 遗传学实验 粗糙链孢霉的杂交

2 实验目的 通过对链孢霉杂交所产生的子囊孢子的观察统计和分析，了解顺序四分子的遗传学分析方法 观察基因分离和交换的现象，进一步验证分离
交换定律 学习掌握重组值的计算方法及着丝粒作图的方法

3 实验原理 粗糙链孢霉（Neurosporacrassa）属于真菌中的子囊菌纲。它是进行顺序排列的四分体的遗传学分析的好材料。粗糙链孢霉的菌丝体是单倍体（n=7），每一菌丝细胞中含有几十个细胞核。由菌丝顶端断裂形成分生孢子。分生孢子萌发成菌丝，可再生成分生孢子，周而复始，这是粗糙链孢霉的无性生殖过程。粗糙链孢霉的菌株有两种不同的接合型（matingtype），用A、a或mt+、mt-表示，它们受一对等位基因控制。不同接合型菌株的细胞接合产生有性孢子，这过程称为有性生殖。 粗糙链孢霉是遗传分析的一种很好的材料。单倍体，无显隐性的复杂问题；一次只分析一次减数分裂的产物个体小，长得快，易于培养，一次杂交产生大量后代；进行有性生殖，染色体结构和功能类似高等动植物；可进行四分子分析和着丝粒作图。

4 实验原理 本实验用赖氨酸缺陷型（记作Lys-）与野生型（记作Lys+）杂交，得到的子囊孢子分离为4个黑的（＋），4个是灰的（-）。黑的孢子是野生型；赖氨酸缺陷型孢子成熟迟，所以呈灰色。根据黑色孢子和灰色孢子在子囊中的排列顺序，可有6种子囊类型。 子囊型 （1）＋＋＋＋—――― ╲第一次分裂分离 子囊型 （2）――――＋＋＋＋ ╱ 子囊型 （3）＋＋――＋＋―― ╲ 子囊型 （4）――＋＋――＋＋ ╲ 第二次分裂分离 子囊型 （5）＋＋――――＋＋ ╱ 子囊型 （6）――＋＋＋＋—－ ╱

5 实验用品 1.材料 ：粗糙链孢霉野生型菌株，Lys+，接合型α。 粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株，Lys-，接合型a。
2. 药品：5％次氯酸钠（NaClO），5％石碳酸 3.器具：显微镜、镊子、解剖针、接种针、载玻片、试管、培养皿

6 实验步骤 1.菌种活化：为使菌种生长得更好，先要进行菌种活化。把野生型和赖氨酸缺陷型菌种从冰箱中取出，分别接在两支完全培养基试管斜面上，28℃温箱培养5天左右。培养到菌丝的上部有分生孢子产生。

7 实验步骤 2.杂交：接种亲本菌株，可采用下述方法。 （1）同时在杂交培养基上接种两亲本菌株的分生孢子或菌丝，25℃温箱进行混合培养。注意要贴上标签，写明亲本菌株及杂交日期。在杂交后5—7天就能看到许多棕色的原子囊果出现，以后原子囊果变大变黑成子囊果，在7—14天左右，就可在显微镜下观察。 （2）在杂交培养基上接种一个亲本菌株，25℃培养5—7天后即有原子囊果出现。同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，悬浊于无菌水中（近于白色的悬浊液），将此悬浊液加到形成原子囊果的培养物表面，使表面基本湿润即可（每支试管约加0.5毫升），继续在25℃培养。原子囊果在加进分生孢子1天后即可开始增大变黑成子囊果，7天后即成熟。

8 实验步骤 3.显微镜观察： （1）在长有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以防止分生孢子飞扬。 （2）取一载玻片，滴1—2滴5％次氯酸钠，然后用接种针挑出子囊果放在载玻片上（若附在子囊果上的分生孢子过多，可先在5％次氯酸钠中洗涤，再移到载玻片上），用另一载玻片盖上，用手指压片，将子囊果压破，置显微镜下（10×15倍）检查，即可见到30—40个子囊。观察子囊中子囊孢子的排列情况。这里用载玻片盖上压片而不用盖玻片，是因为子囊果很硬，用盖玻片压，盖玻片会破碎。也可在显微镜下用镊子把子囊果轻轻夹破，挤出子囊。如发现30—40个子囊象一串香蔗一样，可加一滴水，用解剖针把子囊拨开。此过程无需无菌操作，但要注意不能使分生孢子散出。观察过的载玻片、用过的镊子和解剖针等物都需放入5％的石碳酸中浸泡后取出洗净，以防止污染实验室。

9 实验结果 2.说明粗糙链孢霉中基因分离现象和高等动物、高等植物中基因分离的主要区别。 3.用图表示第六种子囊类型的形成。
1.观察一定数目的子囊果，记录每个完整子囊的类型，计算Lys基因的着丝粒距离。 2.说明粗糙链孢霉中基因分离现象和高等动物、高等植物中基因分离的主要区别。 3.用图表示第六种子囊类型的形成。

10 培养基的配制 马铃薯培养基（基本培养基）：也可以代替完全培养基。将马铃薯洗净去皮，切碎，取200克，加水1000毫升，煮熟，然后用纱布过滤，弃去残渣，滤下的汁加2％琼脂，20克蔗糖，煮融，分装到试管中。也可将马铃薯切成黄豆大小的碎块，每支试管放3—4粒，再加入融化好的琼脂、蔗糖。 杂交培养基：将玉米在水中浸软，破碎，每试管放2—3粒，加入少量琼脂（0.1克左右），再放入一小片经多次折叠的滤纸（长约3—4厘米），加上棉塞，消毒即成，不需摆斜面。 上述培养基都需分装到试管后，在8磅压力下消毒30分钟，取出斜摆，成为斜面备用。