微生物实验 实验一 显微镜的使用及微生物形态观察 实验二 活性污泥生物相及藻类形态观察 实验三 微生物的染色 实验四 微生物细胞数的计数

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1 微生物实验 实验一 显微镜的使用及微生物形态观察 实验二 活性污泥生物相及藻类形态观察 实验三 微生物的染色 实验四 微生物细胞数的计数
实验一 显微镜的使用及微生物形态观察 实验二 活性污泥生物相及藻类形态观察 实验三 微生物的染色 实验四 微生物细胞数的计数 实验五 活性污泥不同微生物种群的分离培养与鉴别

2 实验一 显微镜的使用及微生物形态观察 一. 目的 2. 观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的个体形态，学会生物图的绘制。 二. 实验器材
实验一 显微镜的使用及微生物形态观察 一. 目的 1. 了解普通光学显微镜的构造，学习显微镜的使用方法和保养。（高、低倍镜的使用） 2. 观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的个体形态，学会生物图的绘制。 二. 实验器材 1. 光学显微镜 2. 示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌。 1-1

3 机械部分: 镜筒(双筒，两筒间距离可调，上装有目镜） 转换器（3孔，装有物镜） 载物台（中央圆孔、弹簧夹、移动器） 调节器（粗调、细调）
三. 实验内容 (一) 显微镜的构造和使用方法 1. 构造 机械部分: 镜筒(双筒，两筒间距离可调，上装有目镜） 转换器（3孔，装有物镜） 载物台（中央圆孔、弹簧夹、移动器） 调节器（粗调、细调） 镜臂（支撑作用） 镜座（上有光源，亮度可调） 光学部分：目镜（10×、16×） 物镜（低倍镜10×、高倍镜40×、油镜100×） 聚光器（内有光圈调节） 光源（光量可调） 1-2

4 显微镜放大倍数 = 目镜放大倍数 × 物镜放大倍数 物镜上的标识： 1. 25 (0. 65、0
显微镜放大倍数 = 目镜放大倍数 × 物镜放大倍数 物镜上的标识： (0.65、0.25) (40、10） / ↓ ↓ ↓ ↓ 数值孔径 放大倍数 镜筒长 盖玻片厚度 数值孔径： N.A. = n﹒s i n α/ n — 玻片和物镜之间的折射率。 α— 光线最大射入角。 分辨率（最大可分辨距离）＝λ/ N.A λ—波长 1-3

5 2. 显微镜的使用 低倍镜的使用 （1）双手取出显微镜置于实验台上，接上电源，打开开关，调节合适光量。 （2）转动转换器，将低倍镜移至正下方。调节两目镜镜筒间的距离。 （3）将载玻片放在载物台上夹住，移动观察对象于圆孔正中。 （4）侧视物镜，转动粗调将载物台上移，至载玻片距物镜头约５ｍｍ时停止。 （5）双眼向目镜里观察，同时旋转粗调节器使载物台缓慢下移，若标本显出但不清晰，可用细调节器调至清晰。若粗调旋转太快，超过焦点没有看到标本，则必须重复（4）、 (5)步骤。不能在眼睛观察目镜的同时旋转粗调，以防物镜与载玻片相碰撞，造成损坏。 1-4

6 高倍镜的使用 在用低倍镜找到观察目标后，若需要进一步放大观察，将其移到视野中央。用转换器将高倍镜移到镜筒下方，将光量调大一点。若标本不清晰，用细调上下转动使之清晰。（此时不再动粗调） ３．显微镜的维护 （１）将载物台降至最低，取下标本片。 （２）将光量调至最小，关上电源。 （３）用镜头纸先檫目镜、物镜，再擦显微镜其它部分。 （４）将显微镜放入镜箱，还原。 1-5

7 （二）微生物形态的观察 1. 用低倍镜和高倍镜观察颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌、星藻示范片。 2
（二）微生物形态的观察 用低倍镜和高倍镜观察颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌、星藻示范片。 画出微生物形态图，并标明显微镜的放大倍数。 10 ╳ 10 颤藻 1-6

8 实验二 活性污泥生物相的观察 一. 目的 二. 实验器材 1. 学习测量微生物大小。 2. 学习用压滴法制作标本片。
实验二 活性污泥生物相的观察 一. 目的 1. 学习测量微生物大小。 2. 学习用压滴法制作标本片。 3. 观察几种原、后生动物，菌胶团形态。 二. 实验器材 1. 活性污泥混合液。 2. 显微镜、载玻片、盖玻片。 3. 目测微尺、物测微尺。 2-1

9 三. 实验内容 1. 微生物大小的测定 (1) 标定目镜测微尺
1. 微生物大小的测定 (1) 标定目镜测微尺 装在目镜上的目测微尺中央刻有等分为100格或更多格的标尺，使用前要用物测微尺标定。物测微尺中央刻有1mm长的标尺，等分为100格，10μm／格。将物测微尺的刻度朝上放在载物台上，用低倍镜找出物测微尺的刻度，移动物测微尺使其第一条线与目测微尺的第一条线重合，顺着刻度线找出另一条重合线。算出低倍镜下目测微尺每格的长度。换高倍镜用同样方法标定出高倍镜下目测微尺每格的长度。 2-2

10 测微尺示意图 (2) 微生物大小的测量 　　 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当物镜测量微生物的长度和宽度占目测微尺的格数，再按目测微尺1小格的长度换算出微生物的长度和宽度。 2-3

11 2.压滴法观察活性污泥中生物相 （1）压滴法制作标本片
用滴管取活性污泥混合液一小滴，放在载玻片中央。取一块盖玻片先将一边与混合液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在混合液上。片内不能有气泡。 （2）观察活性污泥中生物相 先用低倍镜观察活性污泥中菌胶团、原生动物、后生动物。画出所观察到的生物形态图。标明名称、放大倍数和微生物的大小。 2-4

12 四. 实验结果 1. 标出低、高倍镜下目测微尺每小格的长度（um/格）。 2
四.实验结果 标出低、高倍镜下目测微尺每小格的长度（um/格）。 画出3种污泥中所观察到的生物形态图。标明名称、放大倍数和微生物的大小（um）。 2-5

13 实验三 微生物的染色 一. 目的 1. 学习微生物的染色技术，掌握微生物的单染色法和革兰氏染色法。 2. 学习油镜的操作。 3-1

14 二．染色原理和油镜的工作原理 1．油镜工作原理 因折射或反射而 不能进入 镜头。物象就显 现不清。 为了不使通过的 光线有
油镜的放大倍数最大（100），故镜头焦距短，直径小,但所需光照强度却最大。从标本片透过的光线是从玻片进入空 气，再进入镜头。由于玻璃和空气的介质密度不同，有些光会 因折射或反射而 不能进入 镜头。物象就显 现不清。 为了不使通过的 光线有 所损失，须在油镜与玻片 之间加入折射率和玻璃 (n=1.52）相仿的香柏油 (n=1.515)。故而称之为 “油镜”。

15 2．单染色法原理： 微生物不但个体微小，且无色半透明。要在显微镜下观察清楚，必须染上颜色 。微生物细胞中含有大量的蛋白质等一类两性电解质：在酸性溶液中结合质子带正电；在碱性溶液中给出质子而带负电。等电点一般在pH=2~5。所以，在中性、碱性或弱酸性溶液中，微生物细胞通常带负电荷。碱性染料在电离时，染色部分是带正电荷的，容易与带负电荷的菌体结合使之着色。经染色后的菌体细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下很容易观察。 3-2

16 3．革兰氏染色法原理： 细菌分为G＋和G- ，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌脱色效果不同。G＋菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。复染后仍然保持初染剂的蓝紫色。G-菌由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。 3-3

17 三．实验器材 1．显微镜、香柏油、接种环、酒精灯等。 2．结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄（番红）染液。
3．菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。 3-4

18 四．实验内容 (一) 单染色 1．涂片 取一块载玻片，用记号笔划分出两区域并做上记号，在两区域中央各滴半滴无菌水，用接种环以无菌操作法分别取两种菌种在左右两滴水中，和匀后涂成薄膜。 2．干燥 室温自然干燥或吹干。 3．固定 涂面朝上，通过火焰2~3次。 4．染色 在涂片薄膜上滴加结晶紫染液，使之覆盖2分钟。 5．水洗 傾倒去染液，斜置载玻片，用洗瓶小水流沿玻片边缘冲洗，直至水呈无色为止。 6．干燥 室温自然干燥或用吸水纸吸干。 3-5

19 7. 媒染 加媒染剂碘液使之覆盖1分钟，水洗，吸水纸吸干。
(二)革兰氏染色 完成单染色的1~6步骤后 7. 媒染 加媒染剂碘液使之覆盖1分钟，水洗，吸水纸吸干。 8. 脱色 滴加95% 乙醇数滴使之覆盖16秒钟，立即水洗,吸干。 9. 复染 用沙黄（番红）液复染 2 分钟，水洗，吸干。 3-6

20 (二) 镜检 油镜用完后，用镜头纸沾取乙醇-乙醚混合液擦拭油镜头。再用干的镜头纸擦干镜头。
(二) 镜检 先分别用低倍镜和高倍镜找到要观察的样品区域后，用转换器将物镜转到空挡，在样品区域滴加香柏油，再将油镜慢慢转到工作位置浸入油中。若不清晰，慢慢转动微调直至清楚。 油镜用完后，用镜头纸沾取乙醇-乙醚混合液擦拭油镜头。再用干的镜头纸擦干镜头。

21 五．实验结果 观察两种细菌的形态和颜色，绘出油镜下细菌形态图，说明革兰氏染色的结果。 六．思考题
五．实验结果 观察两种细菌的形态和颜色，绘出油镜下细菌形态图，说明革兰氏染色的结果。 六．思考题 通过实验，你认为革兰氏染色成功关键是那一步？为了避免假阳性或假阴性出现，在对未知菌种做革兰氏染色鉴定时，你认为应该怎样做？ 3-7

22 实验四 微生物的计数 （显微镜直接计数法） 2.观察酵母菌的形态，学习区分酵母菌死活细胞的方法。
实验四　微生物的计数 （显微镜直接计数法） 　　 一．目的 　　 1.了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数板的计数方法。 2.观察酵母菌的形态，学习区分酵母菌死活细胞的方法。 二. 实验器材 显微镜、血球计数板、酵母菌液、美蓝染液、盖玻片。 4-1

23 　 三．原理 血球计数板计数原理 　　 血球计数板是一块特制的载玻片，有四条竖槽和一条横槽。横槽两边的平台上各有一个有九个大方格的方格网，中间大方格为计数室：边长为１ｍｍ，深为0.1mm，容积为0.1mm3(10-4ml)。计数室有两种规格：一是分为16个中方格，每中方格中有25个小方格；另一种是分为25个中方格，每中方格有16个小方格。两种都共有400个小方格。 4-2

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25 计数： 数出5个中方格中的总菌数A，若菌液的稀释倍数为B，则计算公式如下：
(1) 25个中方格的计数板计算公式 (2) 16个中方格的计数板计算公式 4-3

26 2. 区分酵母菌死活细胞基本原理 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型是无色。用美蓝对酵母菌的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的或淡蓝色，而死细胞或代谢作用的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。

27 四. 实验内容 1. 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
(1) 在载玻片上加半滴美蓝染液，在染液上滴一滴菌液。取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下盖在菌液上。 (2) 将标本片放3分钟后，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。

28 (2) 加样品 在血球计数板上盖上盖玻片, 用滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴,菌液会自动进入计数室，静置5分钟。
　 2. 酵母菌液的计数 (1) 镜检计数室 对计数板进行镜检。若有污物，则用自来水冲洗，用电吹风吹干后 才能 进行计数。 (2) 加样品 在血球计数板上盖上盖玻片, 用滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴,菌液会自动进入计数室，静置5分钟。 (3) 计数 将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。每计数室计5个中格（四角和中间）。计数原则：计上不计下，计左不计右。芽体占母细胞一半时算一个。 (4) 清洗血球计数板 计数后将血球计数板用自来水冲洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必须重复洗涤干净为止。 4-4

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30 五. 结果记录 1. 2.酵母菌的生物图和死活细胞的比例。 六. 思考题 用此法计数的结果是活菌体还是死、活菌体的总和？ 4-5

31 实验五活性污泥不同微生物种群的分离培养与鉴别
一. 目的 1．掌握配制培养基和制备无菌水的方法。 2. 学会玻璃器皿的干热灭菌和培养基高压蒸汽灭菌技术。 3. 学习倒平板的方法和两种分离微生物的基本操作技术。 4. 学习微生物分离、培养、初步鉴别及菌落的观察。 5-1

32 二. 实验器材 1.培养皿、试管、吸管、锥形瓶等。 2.牛皮纸等包扎材料。 3. 10% HCl、10% NaOH、精密pH试纸。
二. 实验器材 1.培养皿、试管、吸管、锥形瓶等。 2.牛皮纸等包扎材料。 3. 10% HCl、10% NaOH、精密pH试纸。 4.牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、 NaCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO47H2O、KH2PO4、1%孟加拉红、10%苯酚、链霉素、琼脂/结晶紫染液等。 5. 高压蒸汽灭菌锅等。 6. 活性污泥。 7．接种环、酒精灯、恒温箱(培养箱)等。 8．显微镜、载玻片。

33 三. 实验内容 （一）培养基的制备及灭菌 1. 玻璃器皿的包扎与灭菌 （1） 六套培养皿一组, 用报纸包装。
三. 实验内容 （一）培养基的制备及灭菌 1. 玻璃器皿的包扎与灭菌 （1） 六套培养皿一组, 用报纸包装。 （2） 取四支吸量管，用长报纸条包扎。 （3） 干热灭菌:上述玻璃器皿在160°C烘箱内2小时。 2.无菌水的制备 在3支试管中各装入9ml自来水，塞上硅胶塞, 同下述培养基一起用高压蒸汽灭菌。 5-2

34 3. 培养基的制备（选一种） 牛肉膏蛋白胨培养基配方： 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 琼脂 自来水 pH 0.75g 2.0g 1.0g 4.0g
200ml 7.4~7.5 高氏1号培养基配方： 可溶性淀粉 NaCl KNO3 K2HPO4 MgSO4 FeSO4 琼脂 水 pH 4g 0.1g 0.2g 0.002g 3~4g 200ml 7.4 马丁氏培养基的配方： KH2PO4 MgSO4 蛋白胨 葡萄糖 1/3000孟加拉红 琼脂 水 pH 0.2g 0.1g 1g 2g 20ml 3~4g 160ml 自然 5-3

35 [1]配制溶液 ： 按培养基的配方，称取各种原料。将上述各物依次加入烧杯（高氏1号培养基先将淀粉用一个小烧杯调成糊状，再加入所需水量的沸水中，加热使淀粉完全溶化，再将其它成分依次溶化 ），在电炉上加热溶解时应不断搅拌以防原料在杯底烧焦。注意补充水。 [2] 调pH值： 溶液稍冷后用pH试纸、10% NaOH或10%HCl 调整溶液 pH。 [3] 分装：试管4支各装其高度1/5的溶液，其余溶液装锥形瓶。 [4] 加塞包扎 ：锥形瓶加棉塞并用牛皮纸包扎。 [5] 湿热灭菌 ： （高压蒸汽灭菌）1.05kg/cm2(103kPa)、 121℃灭菌 20min。 [6] 搁置斜面： 试管培养基冷至50℃时斜搁使斜面长度不`超过试管一半。

36 （二）微生物的分离、培养及形态观察 1. 平板划线分离法 (1) 倒平板: 将融化并冷至50℃的细菌培养基（向高氏1号培养基中加入10%的苯酚几滴；向马丁氏培养基中加入0.03%链霉素溶液20毫升）倒约15~20ml于无菌培养皿中，立即放在桌上轻轻转动使之均匀。冷后成平板。（3个） (2) 划线：在火焰旁，左手拿平板，右手拿接种环，取一环菌液（原污泥）在平板上划线。常用的方法有如下三种： 划线完毕后盖上皿盖，平板 倒置于37℃恒温箱中培养1~2天 （高氏1号和马丁氏培养基于 28℃恒温箱内培养3~5天）后观察结果。 6-1

37 2.稀释平板分离法 (1) 取样 … (2) 稀释水样 以无菌操作按十倍稀释法用无菌吸量管和无菌水将10-3倍的水样稀释至10-4、10-5、10-6倍。 (3) 平板制作 将三套无菌培养皿编号，将上述三种浓度的水样各吸0.5ml 于相应的培养皿中。加热融化培养基，待其冷至约45℃时以无菌操作倾注10~15ml 入培 养皿中，马上将培养皿平 放桌上 轻轻转 动使之混合均匀， 冷却后 成平板。 倒置，于 37℃培 养1-2天（高氏1号和 马丁氏培养基于 28℃培养3~5天） 后观察结果。 6-2

38 3．菌落形态特征的观察 4．微生物个体形态观察 观察平板上菌落的形态、结构、大小、菌落高度、颜色、透明度、气味及粘滞性等。
选定2个菌落。分别涂片，干燥后固定，用结晶紫染色，干燥后用油镜观察。并绘制形态图。 5. 纯种培养 在培养好的平板上选定一个 典 型的菌落。将接种环在火焰上 灼烧灭菌。以无菌操作法轻轻挑取 少许菌种，迅速将接种环伸进斜面 试管中，在培养基上由底部向顶部 轻轻划线。试管塞好塞子，在37℃ 培养1天（高氏1号和马丁氏培养基于28℃培养3~5天）后观察。 6-4

39 你从活性污泥中分离出几种微生物，属哪个微生物类群？描述选定的2种菌落的形态特征，画出2种微生物的个体形态。
四. 实验结果： 你从活性污泥中分离出几种微生物，属哪个微生物类群？描述选定的2种菌落的形态特征，画出2种微生物的个体形态。 五.思考题： 1. 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高、时间长？ 2. 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？ 3. 分离活性污泥为什么要稀释水样? 你考虑怎样来进行生物膜法中生物膜的纯种分离和培养?