氨基酸的分离鉴定——纸层析法.

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1 氨基酸的分离鉴定——纸层析法

2 一、实验目的 掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待 测样品的氨基酸成分。

3 二、实验原理 纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。 溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示： Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。

4 三、实验器材 （1）大烧杯（5000mL）：1只/组 （2）微量注射器（100L）：1只/ 组。 （3）喷雾器：公用。
（4）培养皿：1只/组。 （5）层析滤纸（长22cm、宽14cm的新华一号滤纸）：1张/组。 （6）直尺、铅笔：自备。 （7）电吹风：1只/组。 （8）托盘、针、白线：1套/组。 （9）手套：1双/组。 （10）塑料薄膜：公用。 （11）小烧杯：50mL，1只/组。

5 四、实验试剂 （1）扩展剂：将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中，与5体积水混合，充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。
（2）氨基酸溶液：0.5%的已知氨基酸溶液3种（赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸），0.5%的待测氨基酸液1种。 （3）显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。

6 实验试剂

7 五、实验操作 检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。
（1）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料薄膜密封起来，平衡20min。

8 （2）规划：带上手套，取宽约14cm、高约22cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位），参见左图。

9 （3）点样：用微量注射器分别取10mL左右的氨基酸样品（每取一个样之前都要用蒸馏水洗涤微量注射器，以免交叉污染），点在这四个位置上。挤一滴点一次，同一位置上需点2～3次，2～3mL/次，每点完一点，立刻用电吹风热风吹干后再点，以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。每人须点4个样，其中3个是已知样，1个是待测样品。

10 （4）层析：用针、线将滤纸缝成筒状，纸的两侧
边缘不能接触且要保持平行，参见图3-3。向培养皿中加入扩展剂，使其液面高度达到1cm左右，将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面在A线下约1cm），罩上大烧杯，仍用塑料薄膜密封。当扩展剂上升到A线时开始计时，每隔一定时间测定一下扩展剂上升的高度，填入表3-1中。当上升到15～18cm，取出滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿线，迅速用电吹风热风吹干。

11 （5）显色：用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后立即用热风吹干，即可显出各层析斑点，参见左图。

12 （6）计算各种氨基酸的Rf值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表3-2。
（7）以层析时间为横坐标，扩展剂上升高度为纵坐标画图，求出扩展剂上升到18cm时所需要的时间。 （8）将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净，倒掉用过的展层液和平衡液，将培养皿洗净，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。 计算 Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离  

13 记录与计算汇总 扩展剂前沿上升速度 X（min） 5 10 15 20 30 40 60 90 … 18 Y（cm）

14 纸层析结果 赖氨酸 苯丙氨酸 缬氨酸 待测氨基酸 原点到层析斑点中心的距离 原点到溶剂前沿的距离 Rf 判断待测氨基酸