蛋白质的分离纯化.

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1 蛋白质的分离纯化

2 主要参考书 《蛋白质化学导论》 孙崇荣 （复旦大学出版社） 《蛋白质化学研究技术与进展》 夏其昌 （科学出版社） 常用的蛋白质数据库
夏其昌 （科学出版社） 常用的蛋白质数据库 // // //

3 1 材料获得：天然获得； 基因工程手段 获得。 2 粗分离：除去大量杂质和杂蛋白，初步 浓缩目的蛋白。 3 细分离：常压柱层析 （1）分子筛层析 （2）离子交换层析 （3）疏水层析 （4）亲和层析

4 4 电泳：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电 聚焦电泳，双向电泳。 5 蛋白质鉴定 （1）蛋白质纯度鉴定 （2）蛋白质浓度测定 （3）蛋白质活性测定

5 蛋白质的结构研究 一级结构： 二级结构： 高级结构：（1）X－射线衍射法 （1）氨基酸组成分析 （2）末端分析 （3）肽谱分析
（1）紫外光谱法 （2）荧光光谱法 （3）红外光谱法 （4）圆二色性法(CD谱) （5）激光拉曼光谱法 高级结构：（1）X－射线衍射法 （2）核磁共振法(NMR)

6 蛋白质结构与功能的关系 1.突变 2.晶体分析 3.蛋白与蛋白的相互作用

7 一. 材料获得 （一）天然材料： 新鲜，含量丰富，易于提取，价格便宜。 （二）基因工程产物： 对于天然不易得到的蛋白，通过工程菌或工程
e.g.钙调素：动物的脑组织，植物花粉 胰蛋白酶抑制剂：大豆种子 溶菌酶：鸡蛋清 抗体：血清 （二）基因工程产物： 对于天然不易得到的蛋白，通过工程菌或工程 细胞表达而获得。

8 1 原核细胞表达 大肠杆菌 表达载体：目前较常用的是具有可诱导的T7启动子的表达载体，大部分蛋白均可获得表达而且表达量较高，表达量可占细菌总蛋白的25％以上。T7－RNA聚合酶的活性高于大肠杆菌RNA聚合酶，它只识别自己的启动序列，不能启动大肠杆菌DNA的转录，对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素如利福平有抗性，因而可在利福平存在的条件下，使目的基因得到大量扩增。 宿主菌：细菌染色体上含有噬菌体T7－RNA聚合酶基因，它的启动子为Lac启动子，可被IPTG诱导。 融合蛋白：常用6－10组氨酸－融合蛋白，只增加几个氨基酸，对蛋白质结构影响较小。GST－融合蛋白，选择大肠杆菌偏爱的密码子，容易表达外源蛋白。融合蛋白往往有利于表达和纯化。 用途：制备抗体，生化性质研究，结构研究。

9 优点：操作简单，产量高，成本低。 缺点：表达产物缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 培养条件：根据不同研究目的，选择培养条件。 如制备抗体只需得到包涵体，因为包涵体容易纯化而且制备抗体不需活性蛋白。包涵体是细菌大量表达外源蛋白时，由于蛋白形成过多过快而不能正常折叠而形成的不溶性颗粒。 生化性质研究和结晶需要有活性的可溶性蛋白，需要选择培养条件如低温，降低表达速度，添加辅助因子，改变宿主菌等。

10 E. Coli vector E. Coli vector

11 Different protein expression in E. coli

12 Activity curve of expressed protein from E.coli

13 2 真核细胞表达 （1）酵母 （2）动物细胞 表达载体：诱导型载体如pBM150(GAL1启动子)，pAM82(PHO5启动子)；
组成型载体pAAh5(ADH1启动子)。 宿主细胞：营养缺陷型菌株如URA3－，LEU2－，HIS3－，TRP1－等。 （2）动物细胞 表达载体：SV40复制起点, （CMV或SV40）病毒启动 宿主细胞：人Hela细胞，猴COS细胞，小鼠3T3细胞等

14 （3）植物细胞 表达载体：CaMV-35S启动子，Ti质粒左右 边界 宿主细胞：烟草TBY2细胞 优点：表达产物经过正确修饰，一般具有
天然活性。 缺点：操作比较复杂，表达量较低，成本 较高。

15 Yeast vector Yeast vector

16 Animal vector Plant vector Animal vector

17 （一）破细胞 （二）抽提 动物，植物细胞：匀浆，研磨 大肠杆菌：冻融，超声，溶菌酶 1.pH：选择合适pH的缓冲液，如Tris，磷酸
盐，醋酸盐，柠檬酸盐缓冲体系，保证待 分离蛋白在此pH条件下稳定。一般缓冲液 浓度为20－50mM。 2.温度： 低温如4－10℃，蛋白酶活性较低。 3.离子强度：如0.1－0.2 M NaCl或KCl. 4.其他成分：还原剂如NaHSO4，维生素C；巯基保 护剂DTT，巯基乙醇；金属螯合剂 EDTA，EGTA；蛋白酶抑制剂PMSF。

18 （三）初步分离 （四）粗分蛋白 （五）除盐 1.分离细胞器： 离心，超离心 2.除核酸： 酶法DNase,RNase；超声
3.除脂肪： 丙酮，脂肪酶 （四）粗分蛋白 1.盐析（AS）： NaCl，(NH4)2SO4沉淀 2.有机溶剂抽提： 甲醇，乙醇，丙酮 3.等电点沉淀： 除去杂蛋白 4.热变性： 除去杂蛋白 eg.SOD酶 （五）除盐 1.超滤 2.凝胶过滤 3.冻干

19 三、细分离 层析一般步骤： 处理介质 ↓ 装柱 平衡 上样 洗涤 洗脱 介质再生

20 （一）凝胶过滤： 举例1：从鸡蛋壳膜中制备溶菌酶 溶菌酶：分子量为14KD， 等电点为11， 耐热，能够水解革兰氏阳性细菌
的细胞壁，鸡蛋清中含量丰富。

21 加聚丙烯酸，收集沉淀，在沉淀中加入少量50％的CaCl2，离心取上清
纯化步骤： 150克鸡蛋壳，1％ NaCl—0.05 N HCl ,40℃抽提 ↓ 20％醋酸调pH4.6，75℃处理3分钟，离心取上清 加聚丙烯酸，收集沉淀，在沉淀中加入少量50％的CaCl2，离心取上清 在上清中加NaCl至终浓度5％，将样品加到Sephadex G-50层析柱中(5X25cm)，0.6% NaCl洗脱，流速40毫升/小时，收集洗脱液5ml/管 测活，合并含溶菌酶部分 聚乙二醇(PEG)浓缩 结晶

22 举例2：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 （mg） （U） （U/mg蛋白） （%）
纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 （mg） （U） （U/mg蛋白） （%） 1、粗酶液 2、乙醇沉淀 3、醋酸钙沉淀 4、盐析 5、丙酮沉淀 6、结晶

23 Separation of a sample of test proteins on Superdex 200 HR 10/30

24 Separation of standard peptides on Superdex Peptide HR 10/30

25 (二)离子交换层析 Separation of the major type I collagen cyanogen bromide peptides on Mono S Separation of the major type I collagen cyanogen bromide peptides on Mono S

26 Recombinant human superoxide dismutase produced by Saccharomyces cerevisiae is purified directly from clarified cell homogenate on Q Sepharose Fast Flow after desalting and buffer exchange on Sephadex G-25. A 2.6 × 5 ml ion exchange column handles 390 ml of sample in 45 min

27 举例：利用Phenyl-Sepharose F.F.纯化牛脑钙调素
(三) 疏水相互作用 举例：利用Phenyl-Sepharose F.F.纯化牛脑钙调素 取新鲜或冷冻牛脑100mg，加入100毫升预冷的抽提液（50mM Tris-Cl, 20 mM NaHSO4, 0.15 M NaCl, 1mM EDTA,1mM DTT, 1mM PMSF, pH 7.5）,匀浆。 ↓ 分批热处理每次20毫升，迅速升温到90℃并维持3分钟，迅速降温到10℃以下 离心15，000rpm，30 分钟，取上清，补加CaCl2到5mM 上清加到用抽提液平衡的Phenyl-Sepharose F.F.柱上,并用平衡液洗涤 用含有0.5M NaCl的平衡液洗涤 用50mM Tris-Cl, 20 mM NaHSO4, 0.15 M NaCl, 2mM EDTA,1mM DTT, pH7.5洗脱液洗脱 收集洗脱峰

28 Separation pattern of a cell culture supernatant after a one-step separation with Butyl Sepharose 4 Fast Flow

29 Isolation of a monoclonal antibody, IgG1 with Phenyl Sepharose 6 Fast Flow

30 (四)亲和层析 Affi-gel Affi-Gel 10 and Affi-Gel 15 Media
Affi-Gel 10 and Affi-Gel 15 affinity media provide spontaneous, rapid and highly efficient coupling of ligands via primary amines. Affi-Gel 10 and 15 gel offer Spontaneous coupling Aqueous and anhydrous coupling conditions Protein coupling completed within 4 hours at 4°C Protein coupling capacity up to 35 mg/ml gel

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32 四. 电泳 注意安全！！！ 电泳是指带电粒子在直流电场中移动的现象。聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种利用人工合成的凝胶作为支持介质的区带电泳。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺经过聚合交联从而形成的三维空间凝胶网络。 注意安全！！！

33 (一）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小，当蛋白质的分子量在15，000－200，000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系，符合如下方程式： lg MW = －b  m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数。因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量。 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异分为连续系统和不连续系统，由于SDS－不连续系统具有较强的浓缩效应，因此具有更高的的分辨力也就更多地为人们所采用。

34 五. 蛋白质的鉴定 （一）浓度鉴定 有吸收。 2 Lowry法： 蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合 物，此复合物及芳香族氨基酸还原
1 紫外法(UV)：蛋白质的芳香族氨基酸在280nm 有吸收。 2 Lowry法： 蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合 物，此复合物及芳香族氨基酸还原 磷钼酸－磷钨酸试剂产生蓝色。 3 Bradford法：蛋白质与考马斯亮蓝染料的结合量 4 凯氏定氮法 5 双缩脲法

35 （二）纯度鉴定 （三）分子量测定 1 电泳法：SDS－PAGE， IEF 2 化学法：N端测定， C端测定
3 仪器法：HPLC，质谱，氨基酸组成分析 （三）分子量测定 1 SDS－PAGE 2 凝胶过滤 3 氨基酸组成分析 4 毛细管电泳

36 （四）等电点pI测定 （五）活性测定 等电聚焦电泳 1 激酶：标记ATP 2 磷酸化酶：定磷 3 利用靶酶活性 4 氧化还原酶
5 ELISA