第四章 沉淀技术（Precipitation）

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1 第四章 沉淀技术（Precipitation）
沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，目前仍广泛应用在工业上和实验室中。 由于其浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法，用于从去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质，然后再利用色谱分离等方法进一步提高其纯度。

2 第一节 概述 一、沉淀法的概念： 用加入试剂（沉淀剂）的方法，引起溶质周围物理环境的变化来降低溶质溶解度，使产物形成固相从溶液中析出而达到分离的一种技术。 具有浓缩与分离的双重作用。

3 二、沉淀法的优缺点： 优点： A、设备简单、成本低、原料易得 B、产物浓度愈高的溶液中沉淀越有利、收率越高； C、沉淀法由于成本低、收率高(不会使蛋白质等大分子失活)、浓缩倍数高可达l0-50倍和操作简单等优点，是下游加工过程中应用广泛的方法。 缺点： 过滤较困难；沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类等→产品质量较低，需重新精制

4 三、沉淀和结晶的区别：形态上的无规则和有规则
四、沉淀法的分类： 1、盐析法 、等电点沉淀法 3、有机溶剂沉淀法 、非离子多聚物沉淀法 5、变性沉淀法 、生成盐类复合物沉淀法 7、亲和沉淀法 、SIS聚合物与亲和沉淀法

5 第二节 蛋白质表面性质 一、蛋白质表面特性 亲水性和疏水性： 有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水蛋白所占的%等。如白蛋白
第二节 蛋白质表面性质 一、蛋白质表面特性 亲水性和疏水性： 有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水蛋白所占的%等。如白蛋白 不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水蛋白所占的%等。如纤维蛋白原。

6 二、蛋白质表面的电荷 三、蛋白质溶液的稳定因素 1)、水化层(hydration shell)
Tight hydration shell Protein core Loose hydration shell 1)、水化层(hydration shell) tight hydration shell(0.35g water/1g pro) loose hydration shell(2g water /1g pro) 2)、静电排斥  zeta电势 Nernst Potential—胶核表面电位(不可测) Stern Potential—(不可测)  Potential—滑面电位(可测,mobility) 水化层 zeta电势 静电排斥

7 三、蛋白质胶体的稳定性 蛋白质稳定性的因素主要有二个： 蛋白质周围的水化层、蛋白质分子表面双电层的静电斥力 （一）蛋白质周围的水化层 （二）蛋白质分子的静电斥力

8 1、分散双电层 蛋白质胶粒表面的双电层结构： 1）吸附层（紧密层）；2）扩散层。

9 2、双电层的电位 φo 不同界面上形成不同的电位: 胶核表面的电位φo是整个双电层的电位; Stern平面上的电位为φs; 滑移面上的电位为ζ,称ζ(zeta)电位。 φs

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11 第三节 蛋白质沉淀方法★ 一、中性盐盐析法 （一）盐析法（Salting-out）的概念和原理：
第三节 蛋白质沉淀方法★ 一、中性盐盐析法 （一）盐析法（Salting-out）的概念和原理： 1、概念：蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析。

12 （1）高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静电排斥作用减弱.在布朗运动的互相碰撞下容易发生凝聚，进而沉淀析出。
2、基本原理 ： （1）高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静电排斥作用减弱.在布朗运动的互相碰撞下容易发生凝聚，进而沉淀析出。 （2）中性盐比蛋白质具更强的亲水性，因此将与蛋白质争夺水分子，使蛋白质水化膜破坏。

13 蛋白质的盐析图解

14 从以上分析可知，在蛋白质溶液中加入中性 盐后会压缩扩散双电层，降低ζ电位，即中性 盐既会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带 的电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，在布 朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚 集物而沉淀析出。 3、高浓度的盐能促使蛋白质沉淀或聚结的现象，还不能很好地从理论上来解释。

15 lgS=β－Ks I β=lgS0 I= （二）盐析公式 Cohn经验方程式： S:蛋白质的溶解度,g/L I:离子强度
Ks：盐析常数，斜率，与盐和蛋白质的种类有关,与温度和pH无关。 β : 常数,截距,与温度、pH和蛋白质种类有关,与盐的种类无关

16 1、Ks分级盐析法:在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法，用于蛋白质粗提。
而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。

17 3、Ks盐析常数的物理意义: Ks与蛋白质及盐的种类有关
各种蛋白质均在自己的一定盐浓度范围内沉淀，未达到这个浓度之前，即使增加盐浓度也不影响蛋白质的溶解度。

18 Ks值的影响 Ks：盐析常数，与溶液的pH及温度无关，只依赖于蛋白质及盐的种类 当蛋白质及盐种类一定时， Ks恒定
（NH4）2SO4 Na2SO4 牛血红蛋白 0.71 0.76 牛肌红蛋白 0.94 卵清蛋白 1.22 血纤维蛋白原 1.46

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20 4、β的物理意义: β值特性及其影响 β值为蛋白质在纯水中即离子强度为零时的假想溶解度对数值
取决于蛋白质的种类，当蛋白质一定时，是pH值和温度的函数 pH对β影响：在蛋白质等电点pI时β往往最小。 由于β代表溶解度的对数，故β 变化一个单位，溶解度就变化 10倍。 两种蛋白质的相对溶解度会随pH而变化很大；例如从图 上可见， 当 pH从5变到6时，在一定盐浓度下，两种蛋白质溶解度之比的变化可达几千倍。

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22 （三）常用的盐析剂： 最常用盐析剂—（NH4）2SO4： 优点： 缺点： （四）影响盐析的因素： 1、无机盐的种类及加入量 2、蛋白质的种类和浓度 3、温度 4、溶液的pH

23 （1）阴离子盐析效果次序：（高价阴离子比一价阴 离子盐析效果好）
1、无机盐的种类和加入量的影响： 盐析用盐要求 盐析作用强 该盐有足够大的溶解度，适于低温操作 生物惰性 密度小 来源丰富 （1）阴离子盐析效果次序：（高价阴离子比一价阴 离子盐析效果好） 柠檬酸根（-3价）＞ H2PO-4＞SO2-4＞CH3COO-＞Cl-＞ NO-3＞SCN-

24 （2）阳离子盐析效果次序：（低价阳离子比高价
阳离子盐析效果好） NH+4＞K+＞Na+＞Mg2+

25 （3）无机盐的加入量的影响: 图：血清白蛋白和碳氧肌红蛋白的溶解曲线（a）和盐析分布曲线(b)

26 蛋白质种类的影响： 2、蛋白质种类和起始浓度的影响 蛋白质的种类不同，Ks值会有所不同； 分子量越大，沉淀所需盐的量越少；
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀。

27 蛋白质起始浓度的影响： 58 % -65% 66 % -73% 图：不同浓度碳氧 肌红蛋白的盐析分布曲线

28 结论： （1）沉淀同一种蛋白质，所需盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度有关。 [Prot] ↑，[盐]↓。
同一种蛋白质的不同浓度溶液的沉淀曲线会发生变化 如：30g/L的碳氧肌红蛋白，在饱和度为58-65%的硫酸铵中能大部分沉淀 若稀释10倍后，在饱和度为66%的硫酸铵中仅刚开始出现沉淀，直到73%饱和度时沉淀才比较完全 对于单一的蛋白质溶液，盐析时蛋白质浓度尽可能控制在较高范围；对复杂混合体系，蛋白质浓度一般控制在25-30mg/ml

29 应用：在实际操作中，如要将盐析分布曲线互相重叠的两种Prot，分级沉淀，则可将该溶液适当稀释，即可把它们分级分离。
（2）蛋白质浓度大时，中性盐的极限沉淀浓度低，共沉作用强，分辨率低，但用盐量减少、蛋白质的溶解损失小。 （3）相反，蛋白质浓度低时，中性盐的极限沉淀浓度高，共沉作用小，分辨率高，但用盐量增大、蛋白质的回收率低。 应用：在实际操作中，如要将盐析分布曲线互相重叠的两种Prot，分级沉淀，则可将该溶液适当稀释，即可把它们分级分离。

30 3、pH和温度的影响 温度： 在高离子强度溶液中，温度升高蛋白质失水，溶解度下降。T ，   ，有利于蛋白质析出。
在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内一般随温度升高而增大。 在保证蛋白质不变性的情况下，适当调节温度，可促使沉淀易于生成

31 pH值： 在接近蛋白质等电点的溶液中进行盐析有利于蛋白质的沉淀。需要注意在高盐溶液中蛋白质的等电点会发生偏移。

32 左图； pH值对β的影响

33 其中之一发生变化引起β发生变化,Ks不受影响。
β 随pH的变化规律： 由于β代表溶解度的对数，故β 变化一个单位，溶解度就变化 10倍。 β在pI附近有极小值。两种Prot 相对溶解度会随pH变化而变化很大；从图 上可见， 当 pH从5变到6时，在一定盐浓度下，两种蛋白质溶解度之比的变化可达几千倍。

34 在一定的浓盐溶液中，调节蛋白质混合溶液的pH，在β差别相对较大的区域里能达到选择性沉淀。
如酵母提取细胞色素C：先调节pH为 ，加硫酸铵使饱和度达85%，冷室静置后→杂蛋白沉淀→离心后再调节pH →产生红色的细胞色素C。

35 （pH6.6） （T25℃）

36 （五）盐析沉淀的操作 1、硫酸铵盐析法实际应用时的注意点： （1）（NH4）2SO4加入后，会使溶液pH略变酸，为保持pH中性，可加入50mmol/L的磷酸缓冲液； （2）（NH4）2SO4的溶解度在0～30℃变化很少，20℃的饱和溶液的浓度为4.05mol/L（534g/L）饱和溶液密度为1.235kg/L。用1L的水加（NH4）2SO4至饱和，需加入761g固体硫酸铵，体积增至1.425L。

37 1）饱和度是指溶液饱和硫酸铵的体积与溶液总体积之比。 如：70ml酶液+30ml饱和硫酸铵溶液，则混合液中硫酸铵的浓度为
2、硫酸铵加入量的计算 250C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L 定义为100%饱和度 1）饱和度是指溶液饱和硫酸铵的体积与溶液总体积之比。 如：70ml酶液+30ml饱和硫酸铵溶液，则混合液中硫酸铵的浓度为 30/（70+30）=0.3饱和度=30%P 。

38 2）饱和硫酸铵溶液的配制方法： ① 盐析时所需添加的饱和硫酸铵的体积： V=V (mL) V、V0—分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原来溶液的体积（mL） S2、S1—法分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度

39 ②直接加固体硫酸铵到被分离的溶液中，按下式 计算加入量：W= （g）
W—为将1L、S1饱和度的溶液提高到S2 饱和度时，所需加入的固体硫酸铵的克数（g）。

40 S2、S1—分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来 溶液的硫酸铵饱和度（均用小数表示）
（当盐析要求的饱和度高，又不宜增大溶液体积时，可直接加硫酸铵的固体盐） S2、S1—分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来 溶液的硫酸铵饱和度（均用小数表示） A、B——常数，与温度有关。 在0℃时， A为 B为505 在20℃时 A为 B为534

41 20℃ ， G= （已考虑体积的增加） 20℃ ， G= （已考虑体积的增加） 0℃ ，G= (已考虑体积的增加)

42 因此，如果我们说，沉淀某一种蛋白质需要60%饱和度的硫酸铵，那么需要硫酸铵固体的量是多少？

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44 2 、盐析法分级沉淀目标产物的实际操作步骤***
①粗提目标产物(如Prot )时常用Ks 分级盐析法，进一步纯化时常用β分级盐析法 ②加入(NH4)2SO4 的两种方法 ③通过小试实验确定所加的(NH4)2SO4的固体量或其最适(NH4)2SO4饱和度的范围 具体合适的饱和度还要根据同时得到较大的纯化倍数和回收率而定，其中纯度放在首要考虑的位置。

45 图3 盐析沉淀平衡后上清液中蛋白质浓度与硫酸铵饱和度的关系
上清液中蛋白质的相对浓度 选择不使目标蛋白质沉淀的最大饱和度和使目标蛋白质沉淀的最低饱和度 最适饱和度为30%-55% 图3 盐析沉淀平衡后上清液中蛋白质浓度与硫酸铵饱和度的关系

46 二、有机溶剂沉淀法 （一）有机溶剂沉淀法：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 原理：
（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。 （2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。

47 （二）影响沉淀效果的主要因素： 1、温度(非常重要):大多数蛋白质的溶解度随温度降低而下降，且温度升高，会使一些温敏蛋白质或酶变性。故低温操作，通常在-10℃以下。 2、pH：pH≈pI时，蛋白质的溶解度S最低，且有机溶剂用量小 3、离子强度：当存在一定量的中性盐时，蛋白质在有机溶剂水溶液中的溶解度增大。但适量的中性盐能提高蛋白质的稳定性，减少变性。

48 4、多价阳离子：Ca2+、Zn2+等多价阳离子能使蛋白质在水或有机溶剂中的溶解度大大降低，从而减少有机溶剂的用量。
5、蛋白质浓度：蛋白质浓度过低时，会因添加的有机浓度过高而变性；蛋白质浓度过高，易发生共沉淀，但稳定性较好。一般蛋白质起始浓度在0.5%~3%较适宜。

49 （三）有机溶剂的选择 乙醇：沉淀作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉淀；
丙酮：沉淀作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不如乙醇广。 选择有机溶剂时，要考虑的因素： 介电常数小，沉淀作用强。如60%乙醇的介电常数是48，丙酮的介电常数是22； 致变性作用小。毒性小，挥发性适中。水溶性好。容易获取。

50 例：丙酮纯化丁香霉素 培养液冷却至4℃，加入等体积酸化丙酮（含0.4 % HCl的丙酮），混匀，8,000 g 离心15 min。弃沉淀，收集上清液，45 ºC旋转闪蒸，将上清液浓缩为原体积的10%。向浓缩液中加入一定量的丙酮，使丙酮终浓度达到60%，溶液置于4℃层析柜中轻柔搅拌过夜。 4℃ 8000 g 离心15 min去除一切固体残留物，45℃条件下旋转闪蒸完全去除丙酮。

51 例：有机溶剂提取淀粉酶工艺流程

52 三、等电点沉淀法 1、等电点沉淀的概念:利用蛋白质在其等电点时溶解度下降的原理进行沉淀分离的方法。
2、操作条件：离子强度低，pH≈pI（在中性盐存在下略小于pI），用无机酸（HCl、H2SO4、H3PO4等）调节pH

53 由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用。
操作时的注意事项： （1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低 （2）溶质的稳定性 （3）盐析效应

54 3、适用范围 适用于疏水性较大的蛋白质的沉淀,对亲水性的目标产物常与其它方法结合起来使之沉淀。 用该法沉淀杂蛋白及其它杂质.（如胰岛素的纯化）pI=5.3

55 优点： 大多数蛋白质 ，pI＜7，而无机酸价廉,易被蛋白质类食品所允许不必除酸。
缺点： 由于蛋白质对低pH比较敏感，酸化时易使蛋白质失活。

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57 发酵 起晶中和点 pH 4.0~4.5 ↓ 等电搅拌 pH 3.0~3.2 菌体 静置沉降 4~6h ↓ 母液 离心分离 谷氨酸 图2：等电点法提取谷氨酸的工艺流程图 ↓ 盐酸 停酸育晶2h

58 谷氨酸的含量： 发酵液中Glu含量在4%以上时，等电结晶（pI为3.22）操作容易，收率可达60%左右， Glu含量太低，如在 %之间常温下溶液的过饱和率较小，结晶的生成速度慢，收率低，

59 因此，对产酸较低的发酵液，为了提高收率，中和时采用多加高流分子（离子交换柱洗脱下的高脱液，加酸调至1
因此，对产酸较低的发酵液，为了提高收率，中和时采用多加高流分子（离子交换柱洗脱下的高脱液，加酸调至1.5 ,用于等电中和） ，以增加谷氨酸含量，同时，在晶核形成前投入晶种，以促进结晶的形成。 此外，也可在去菌种后在70℃下进行真空浓缩，然后在等电点提取，也可采用离子交换柱，直接吸附分离，再等电结晶。

60 四、其它沉淀法 （一）非离子多聚物沉淀法：类似盐析法，常用聚乙二醇（PEG） （二）变性沉淀法：热变性沉淀，pH变性沉淀
（三）生成盐类复合物的沉淀：金属复合盐，有机酸复合盐，无机复合盐 （四）亲和沉淀： （五）SIS聚合物与亲和沉淀

61 本章小结： 重点：常用的蛋白质沉淀方法，盐析公式的意义及应用 难点：

62 思考题 1、盐析沉淀蛋白质和酶的机理是什么？在实际操作过程中，如何应用盐析法分级沉淀目标蛋白质？
2、溶菌酶在2.8和3.0mol/L硫酸铵溶液中,溶解度分别为1.2和0.26g/L，试计算溶菌酶在3.5 mol/L硫酸铵溶液中的溶解度。 3、盐析沉淀的影响因素 4、蛋白质沉淀的主要方法。 5、 Cohn 方程的形式及其中各参数的物理意义。

63 沉淀法应用（了解内容）见讲义 利用蛋白质沉淀大规模提纯 白蛋白与免疫球蛋白的工艺 柠檬酸的生产 萃取 一沉淀法提取分离茶多酚

64 利用蛋白质沉淀大规模提纯 白蛋白与免疫球蛋白的工艺

65 柠檬酸的生产 柠檬酸生物技术是工业和学术界都感兴趣的领域，长期以来柠檬酸生产是发展工业生物技术并促使新老技术交接的驱动力之一。

66 加热到70度 标准沉淀法回收柠檬酸流程图

67 萃取 一沉淀法提取分离茶多酚 茶多酚是一类富含于茶叶中，主要由表儿茶素、表没食子儿茶素及它们的没食子酸酯类等组成的多羟基酚类化合物，在茶叶干品中的含量一般在20％左右

68 儿茶素类化合物是茶多酚的主要成分， 其结构式可表示为 ：

69 萃取法的一般工艺路线

70 萃取法和沉淀法提取茶多酚工艺图

71 浸提溶剂:80％乙醇作为，萃取回流时间2h 萃取pH值:3～4 沉淀剂:ZnCl2 转溶:6mol/L HCl处理沉淀 茶多酚粗品:含量约70％，棕色结晶性粉末 精茶多酚:含量85％ 以上，浅黄色结晶。

72 思考题： 1 .盐析法为什么能用于分离蛋白质混合物？一般用于生物分离的哪个阶段？
2 .有20ml的料液，要采用直接加固体硫酸铵的方式进行盐析，其硫酸铵的饱和度为20%，需要达到的硫酸铵饱和度为40%，问需要加入多少硫酸铵固体？ 3 .有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？用乙醇 沉淀蛋白质时应注意哪些事项？ 4.何为选择性变性沉淀法？