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单元(扩充) 繁殖生物技术 Bio-Tec of Reproduction
第一节 体外受精 第二节 发情控制 第三节 其它繁殖生物学技术
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第一节 体外受精 体外受精是指卵母细胞与精子在体外融合,形成合子的过程。体外受精成功的标志是通过移植产生后代。 一、卵母细胞
第一节 体外受精 体外受精是指卵母细胞与精子在体外融合,形成合子的过程。体外受精成功的标志是通过移植产生后代。 卵母细胞:体内;体外 精子:体外获能 一、卵母细胞 1、体内成熟卵母细胞 1)超数排卵:(略,胚胎移植讲) 2)卵母细胞采集 :在内窥镜的导引下,穿刺成熟卵 泡,从卵泡中抽吸卵泡液和成熟卵母细胞。 3)镜检:将吸取的卵泡液及卵母细胞置于评皿中,在 体视显微镜下(25X), 选则合格的卵母细胞,用 于体外受精。
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合格卵母细胞标准:放射 冠细胞扩散良好,质地均 一,放射冠细胞间透明; 透明带清晰;卵母细胞圆 形,直径大小适中,细胞
质质地均匀,色泽柔和, 透明度适中(图-1)。 2、体外成熟的卵母细胞 1)卵母细胞来源 (1)卵巢来源:从屠宰 场宰杀的母畜获得卵巢, 38 °C生理盐水中保温, 宰杀后 2 小时内运回实 验室。 图-1 成熟卵母细胞图
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(2)采集卵母细胞-卵丘细胞复合物:用 38 °C 生理盐水洗涤卵巢 2 次,左手持卵巢,右手持注射器,如图所示,抽取 3-5mm 卵泡
的卵泡液及卵母细 胞-卵丘细胞复合 物,置于20ml试管 内,静置待检。 选择 3-5 mm 卵泡的原因是:更 大卵泡的闭锁比例 可能例高,更小卵 泡的发育程度可能 低。 图-2 卵母细胞-卵丘细胞复合物采集 示意图
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生理盐水配方:NaCl 18g,Mill-Q(或三蒸水)2l,
青霉素2,000,000IU,链霉素2g。 (3)镜检卵母细胞-卵丘复合物:用吸管吸取经静置 后试管底部的混合物于平皿中,用吸管铺平,在实体显微镜下用吸管检出卵母细胞-卵丘复合物,置于另一平皿中,用洗涤液在实体显微镜下洗涤2次,在洗涤过程中要剔除不合格的卵母细胞-卵丘复合物。选择合格的卵母细胞-卵丘复合物非常重要,否则将降低卵母细胞的成熟比例。 卵母细胞-卵丘复合物分类标准 a、分类依据:卵母细胞的直径、形状、质地的均匀度、色泽;透明带的完整性;卵丘细胞围绕卵母细胞的完整性、数量、扩散程度、色泽。 一般分为4级,1、2级为合格;3、4级为不合格。
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一级:卵母细胞:直径120μm,圆形,质地均匀。
卵丘细胞:包围卵母细胞数层、紧密、完整, 质地均匀。 二级:卵母细胞:直径120μm,圆形,质地均匀。 卵丘细胞:包围卵母细胞数层、紧密,但不完 整,质地均匀。 三级:卵母细胞:直径太大或太小,椭圆形,质地均 匀。 卵丘细胞:包围卵母细胞单层或无、不紧密、 不完整,质地均匀。 四级:卵母细胞:直径太大或太小,椭圆形,质地不 均匀。 不完整,质地不均匀。
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体外成熟大多采取液滴或试管培养。液滴培养的 优点是培养液不蒸发,渗透压稳定,缺点是培养液中
(4)卵母细胞-卵丘复合物体外成熟 体外成熟大多采取液滴或试管培养。液滴培养的 优点是培养液不蒸发,渗透压稳定,缺点是培养液中 的脂溶性物质能溶于覆盖的石蜡油;试管培养的缺点是培养液容易蒸发而致渗透压提高。一般来说,采用液滴培养普遍,因此,这里介绍液滴培养。 a、制作体外成熟培养液滴 在一次性利用的平皿(3-6cm)中,用加样器整 齐、小心地加入液滴(大多采用50μl液滴),然后用 石蜡油覆盖,在CO2培养箱中平衡2小时(图-3)。 b、培养 牛:在平衡后的每个液滴中用吸管加入5-10个卵母细胞-卵丘复合物, 39 °C 、5% CO2、湿润环境中培养24小时,卵母细胞成熟,细胞核达到第二次减数分裂。
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外观检查:卵母细胞在成熟过程中,卵丘细胞扩散,因此,卵丘细胞扩散,说明卵母细胞可能成熟(图-4)。
猪:在平衡后的每个液滴 中用吸管加入 5-10 个卵 母细胞-卵丘复合物,在 39 °C 、5% CO2、湿润环 境中培养40-48小时,卵 母细胞成熟,细胞核达到 第二次减数分裂。 c、 成熟卵母细胞的检查 外观检查:卵母细胞在成熟过程中,卵丘细胞扩散,因此,卵丘细胞扩散,说明卵母细胞可能成熟(图-4)。 卵母细胞核成熟:在卵母 图-3 液滴示意图
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染色质浓缩期:染色质染色很深、均一,此为卵 母细胞已经启动第一次减数分裂。 核膜消失期:核膜从断续到完全消失。
细胞成熟过程中,卵母细胞启动第一次减数分裂,依据其核型进行鉴定。在成熟过程中,核型可分为核膜期、染色质浓缩期、核膜消失期、第一次减数分裂中期、第一次减数分裂后期、第二次减数分裂中期。各期特点如下(图-5): 核膜期:经染色后可见完整的核膜。 染色质浓缩期:染色质染色很深、均一,此为卵 母细胞已经启动第一次减数分裂。 核膜消失期:核膜从断续到完全消失。 第一次减数分裂中期:染色体分为两组。此时标 志着卵母细胞核已经成熟。 第二次减数分裂中期:染色体分为两组,可见第 一极体。 卵母细胞质成熟:细胞质成熟较难鉴定,因此,通常 只检查细胞核的成熟。
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卵母细胞核染色(图-6) 制片:压片。 固定:固定液 乙醇:乙酸=3:1,24h 染色:1%地衣红,40%乙酸 镜检:光学显微镜
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图-6 制片、固定、染色 示意图
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液体制备
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二、精子体外获能 三、体外受精 1、牛冷冻精液:Swimming-up 2、猪精液:高Ca离子孵化 3、绵羊精液:肝素+羊血清孵育法
1、制备体外受精液滴:35+15 μl液滴 2、体外受精:10卵子,加获能精子至106精子/ml 3、培养:5%CO2 ,38 °C 培养12小时。
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