脂蛋白的分离、提纯和电泳鉴定 二、脂蛋白琼脂糖凝胶电泳鉴定

Presentation on theme: "脂蛋白的分离、提纯和电泳鉴定 二、脂蛋白琼脂糖凝胶电泳鉴定"— Presentation transcript:

1 脂蛋白的分离、提纯和电泳鉴定 二、脂蛋白琼脂糖凝胶电泳鉴定
上节课我们学习了如何应用化学沉淀法分离高密度脂蛋白及其亚类，今天我们学习另一种脂蛋白分离鉴定技术——脂蛋白琼脂糖凝胶电泳。

2 一、实验目的和要求 掌握血清脂蛋白分类，掌握血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳的基本方法和原理，了解各类脂蛋白的半寿期和主要功能，以及各类脂蛋白的临床意义。 实验目的和要求 掌握血清脂蛋白分类，掌握血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳的基本方法和原理，了解各类脂蛋白的半寿期和主要功能，以及各类脂蛋白的临床意义。

3 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳：是以琼脂糖凝胶作为支持体的电泳。
琼脂糖（Agarose）凝胶是由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖的残基通过氢键交替排列组成的直链多糖。电泳时，因为凝胶中含水量大（98%～99%），固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很小，是一种良好的电泳材料，分离效果较好。 首先我们先了解一下琼脂糖凝胶电泳是什么？ 与聚丙烯胺凝胶电泳不同的是，琼脂糖凝胶电泳：是以琼脂糖凝胶作为支持体的电泳。琼脂糖（Agarose）凝胶是由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖的残基通过氢键交替排列组成的直链多糖。电泳时，因为凝胶中含水量大（98%～99%），固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很小，是一种良好的电泳材料，分离效果较好。

4 二、实验原理 血清中的脂类物质以不同的比例与载脂蛋白结合成脂蛋白。各种脂蛋白所含载脂蛋白的种类和数量不同，其所带的负电荷量和颗粒大小、形状等不同，使其在电场中的泳动速度亦不一样，故可将其分离，用不同方法显色便可进行定性、定量分析。 将血清脂蛋白用脂类染料（如苏丹黑B或油红“0”等）进行预染，在本实验条件下，血清脂蛋白均带负电荷，以琼脂糖凝胶作支持介质进行电泳可将血清脂蛋白分为四个区带。从负极到正极依次是乳糜微粒、β-脂蛋白、前β-脂蛋白和α-脂蛋白。可用光密度计扫描定量，亦可将各脂蛋白区带切下，进行比色定量。 脂蛋白是由血清中的脂类物质以不同的比例与载脂蛋白结合形成的复合物。各种脂蛋白所含载脂蛋白的种类和数量不同，其所带的负电荷量和颗粒大小、形状等不同，使其在电场中的泳动速度亦不一样，故可将其分离，用不同方法显色便可进行定性、定量分析。 将血清脂蛋白用脂类染料（如苏丹黑B或油红“0”等）进行预染，在本实验条件下，血清脂蛋白均带负电荷，以琼脂糖凝胶作支持介质进行电泳可将血清脂蛋白分为四个区带。从负极到正极依次是乳糜微粒、β-脂蛋白、前β-脂蛋白和α-脂蛋白。可用光密度计扫描定量，亦可将各脂蛋白区带切下，进行比色定量。

5 血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳示意图 这是血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳示意图，琼脂糖凝胶电泳后，可以看到脂蛋白被分成三条区带，从负极到正极依次为β脂蛋白（最深）、前β脂蛋白（最浅）及α脂蛋白（比前β脂蛋白略深），在原点处应为乳糜微粒。此法应用于高脂蛋白血症的分型，可将血清脂蛋白分为几种不同的类型，为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病、高血压以及心肌梗死的临床诊断提供生化指标。

6 三、实验步骤 1、预染血清：血清0.2ml中加入苏丹黑B染色液0.02ml及无水乙醇0.01ml，混匀后置37℃水浴30min，2000r／min离心5min。 2、制备琼脂糖胶板：将4g／L的琼脂糖凝胶置沸水浴中加热融化，用吸管取凝胶溶液约3ml注于载玻片上，静置至凝固。 3、加样：在已凝固的琼脂糖凝胶板距一端2.5cm处，用厚约 cm、宽约1cm的玻片(或有机玻璃片)垂直切入形成小槽，用滤纸条吸去水分，再用一细长滴管将预染好的血清加入槽内。 4、电泳：将点样的凝胶板放入电泳槽中，样品近负极端，凝胶板两端分别用4层在电泳缓冲液中浸透的滤纸(或纱布)搭桥，接通电源，电压 V，电泳约45min。 实验步骤如下：1、预染血清：血清0.2ml中加入苏丹黑B染色液0.02ml及无水乙醇0.01ml，混匀后置37℃水浴30min，2000r／min离心5min。 2、制备琼脂糖胶板：将4g／L的琼脂糖凝胶置沸水浴中加热融化，用吸管取凝胶溶液约3ml注于载玻片上，静置至凝固。 3、加样：在已凝固的琼脂糖凝胶板距一端2.5cm处，用厚约 cm、宽约1cm的玻片(或有机玻璃片)垂直切入形成小槽，用滤纸条吸去水分，再用一细长滴管将预染好的血清加入槽内。 4、电泳：将点样的凝胶板放入电泳槽中，样品近负极端，凝胶板两端分别用4层在电泳缓冲液中浸透的滤纸(或纱布)搭桥，接通电源，电压 V，电泳约45min。

7 这是琼脂糖凝胶电泳装置的示意图。由电源和电泳槽两部分组成。注意样品槽位于电源的负极。在高pH电泳缓冲介质中，携带负电荷的脂蛋白向正极移动，以达到分离的目的。

8 四、结果与计算 用刀片切下凝胶板上的各脂蛋白色带，另在空白区切一块平均大小的凝胶作为空白对照，分别置于盛有3.0ml蒸馏水的试管中。各管置沸水浴中3min，使凝胶融化，冷至室温后在660nm处比色，记录光密度。 各区带光密度总和T=OD1+OD2+OD3+OD4 各脂蛋白的百分数= 待脂蛋白经琼脂糖凝胶电泳分离后，我们需要对每一类脂蛋白进行定量测定。本实验我们用刀片切下凝胶板上的各脂蛋白色带，另在空白区切一块平均大小的凝胶作为空白对照，分别置于盛有3.0ml蒸馏水的试管中。各管置沸水浴中3min，使凝胶融化，冷至室温后在660nm处比色，记录光密度。各区带光密度总和T=OD1+OD2+OD3+OD4， 各脂蛋白的百分数按照ppt上的公式计算获得。

9 五、注意事项 1、制板时，载玻片置水平面上，吸管口垂直于玻片中央，让琼脂糖快速流出，自然铺满整个玻片。
2、琼脂糖凝胶娇嫩易坏，应将铺好的琼脂糖凝胶板放在不易碰撞的地方。 本实验需要注意的是： 1、制板时，载玻片置水平面上，吸管口垂直于玻片中央，让琼脂糖快速流出，自然铺满整个玻片。 2、琼脂糖凝胶娇嫩易坏，应将铺好的琼脂糖凝胶板放在不易碰撞的地方。

10 六、临床意义 正常人血清脂蛋白可分离出2条或3条区带，从正极到负极依次为α-脂蛋白、前β脂蛋白(有时无)及β脂蛋白，在原点应为乳糜微粒。
正常参考值： a－脂蛋白＝ 25.7±4.1％ 前b－脂蛋白＝ 21±4.4％ b－脂蛋白＝ 53.3±5.3％ 正常人血清脂蛋白可分离出2条或3条区带，从正极到负极依次为α-脂蛋白、前β脂蛋白(有时无)及β脂蛋白，在原点应为乳糜微粒。 临床上，正常的参考值是a－脂蛋白＝ 25.7±4.1％； 前b－脂蛋白＝ 21±4.4％； b－脂蛋白＝ 53.3±5.3％。 据此可以为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病、高血压以及心肌梗死的临床诊断提供生化指标。

11 八、自测题 是非题： 单选题： 1、在琼脂糖凝胶电泳中脂蛋白向负极移动 。（否） 2、琼脂糖凝胶电泳的电泳缓冲溶液是巴比妥溶液（是）
3、在脂蛋白琼脂糖凝胶电泳中， a-脂蛋白对应于HDL （是） 单选题： 1、在脂蛋白琼脂糖凝胶电泳中，——的条带最粗、颜色最深 （A） A、a-脂蛋白 B、乳糜微粒 C、前b-脂蛋白 D、 b-脂蛋白 2、在脂蛋白琼脂糖凝胶电泳中，——跑的最慢（B） 3、在脂蛋白琼脂糖凝胶电泳中，——跑的最快（A） 本次实验的自测题如ppt所列。