SDS-PAGE鉴定菠萝蛋白酶的纯度.

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1 SDS-PAGE鉴定菠萝蛋白酶的纯度

2 一、实验目的 1、学习和掌握电泳（SDS-PAGE）的基本原理及电泳技术。 2、熟练配制SDS-PAGE相关各种试剂。

3 二、实验原理 电泳:带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。

4 影响电泳的主要因素 （1）颗粒性质：一般说来，颗粒带净电荷量越大，或其直径越小，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就快。反之，则越慢。
（2）电场强度：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。反之，则越慢。 （3）pH值 （4）离子强度：溶液的离子强度一般在0.02～0.2mol/kg之间电泳较合适。 （5）溶液粘度 （6）电渗 （7）焦耳热 （8）筛孔

5 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种电泳。
这种凝胶是由丙烯酰胺单体(简称 Acr)和交联剂 N，Nˊ-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)，在催化剂的作用下聚合而成的。

6 聚丙烯酰胺凝胶聚合的体系有两种，即化学聚合和光聚合。
化学聚合的引发剂是过硫酸铵[(NH4)2S2O3](简称Ap)，催化剂是N，N，Nˊ，Nˊ-四甲基乙二胺(TEMED)。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵(Ap)形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。

7 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。
每100mL凝胶溶液中含有的单体(Acr)和交联剂(Bis)总克数称为凝胶浓度，用T％表示。 凝胶溶液中，交联剂(Bis)占单体(Acr)和交联剂(Bis)总量的百分数称为交联度，用C％表示。

8 不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳，带电颗粒在电场中的泳动有电荷效应、分子筛效应还具有浓缩效应。
(l) 浓缩效应 (2)电荷效应 (3)分子筛效应

9 Gel 15% 5% 10% 200 200 97 200 66 97 66 97 66 45 45 29 29 45 29

10 实验试剂配制 30%凝胶贮液：取30g丙烯酰胺（Acr）、0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis), （先用约50ml蒸馏水溶解，如溶解不了,可加热30~50℃溶解,再用量筒定容至100ml，然后过滤，后置于棕色瓶,4℃下保存备用）。 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套 (2) 10%过硫酸铵(AP)溶液：取2g过硫酸铵溶解后，用20ml dH2O溶解，现配现用。 (3) 1 mol/L HCl 500ml：取浓HCl 42 ml，加蒸馏水至500 ml(在通风橱中操作)。 (4) 分离胶缓冲溶液（1.5mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.8）:取18.15g Tris溶解后，加1mol/L HCl溶液约48ml，调pH至8.8, 定容至100ml。

11 (5) 浓缩胶缓冲液(0. 5mol/L Tris-HCl缓冲液,pH6
(5) 浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl缓冲液,pH6.8): 取6g Tris溶解后，加1mol/L HCl溶液40ml，调pH至6.8，定容至100ml 。 (6) 10%SDS(十二烷基硫酸钠)溶液: 取5g SDS加水定容至50ml。（加热溶解） (7) 2×电极缓冲液(0.1%SDS–0.05mol/L Tris–0.384mol/L甘氨酸缓冲液，pH8.3):取6gTris，28.8g甘氨酸和1g SDS加水溶解后，定容至１000ml（配好的溶液pH8.3）(12个组可配2升,使用时再稀释2倍)。

12 (8) 样品溶解液：取SDS ２g，β-巯基乙醇 ５ml，甘油10ml，溴酚蓝0. 1g，0. 5mol/L pH6
(8) 样品溶解液：取SDS ２g，β-巯基乙醇 ５ml，甘油10ml，溴酚蓝0.1g，0.5mol/L pH6.8 Tris–HCl缓冲液 (浓缩胶缓冲液)10ml，加蒸馏水25ml，(最后的总体积为50 ml),装于棕色瓶。 (9)染色液（0.1%考马斯亮蓝-45%甲醇-10%冰乙酸溶液）：1g考马斯亮蓝R250，加入450 ml 甲醇、100ml冰乙酸，用水定容至1000 ml。(12个组可配2000 ml) (10)脱色液 高甲醇1000ml：甲醇 454ml，冰醋酸75ml，dH2O 471 ml 低甲醇1000ml ：甲醇 50ml，冰醋酸75ml，dH2O 875 ml

13 七．实验步骤 1.清洗并吹干玻璃板。 2.在塑料胶条的两面涂少量凡士林（注意不能涂多，以防弄脏玻璃板）。 3.把玻璃板放入电泳槽中。 4.用小烧杯加6ml蒸馏水，2ml 30%凝胶储液，20 ul TEMED，100ul 10％过硫酸铵，混匀，迅速倒入封口槽处(一定要快！)，静置约10min直到凝固。 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套 5.加dH2O于两层玻璃之间，检查玻璃底是否漏水；如果漏水，要重装。

14 6.按下表用小烧杯配12%分离胶，混匀，灌胶，高度离梳子约1～1.5cm，然后覆盖一层水，凝胶时间为15～30min，胶与水分层，倾倒去水。
5%浓缩胶 30%凝胶贮液 4000μl 810 μl 上层胶缓冲液pH6.8 — 1250 μl 下层胶缓冲液pH8.8 2500μl TEMED（四甲基乙二胺) 30 μl 20 μl 10%SDS 100μl 50μl dH2O 3270μl 2820μl AP（过硫酸氨） 50 μl

15 7.凝好胶，垂直拔掉梳子（不要左右摇梳子）。
8.上槽加入电泳缓冲液（电极缓冲液稀释2倍），液面需没过低玻璃板；下槽电泳缓冲液没过玻璃板封胶处1cm。 9.用1.5ml ep管取100μl粗酶样品与100μl样品溶解液混合均匀，与蛋白质分子量标准一起置于沸水浴5min）。

16 10.微量注射器按下表2点样，隔孔点样，注意不要交叉污染（每点一个样都要清洗微量注射器）。
表2 点样方式 孔 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 加样 粗酶 标准蛋白 过柱1 过柱2 过柱3 体积μL 30～40 30 35 *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔

17 12.恒电流电泳：浓缩胶，10~12 mA，待溴酚蓝迁移到浓缩胶与分离胶的界面调整电流至20mA。
11.上槽接负极，下槽接正极。 12.恒电流电泳：浓缩胶，10~12 mA，待溴酚蓝迁移到浓缩胶与分离胶的界面调整电流至20mA。 13.待溴酚蓝迁移到距分离胶底部0.5~1cm处，结束电泳。 14.染色（20～30min），回收染色液。 15.脱色：高甲醇60~80ml，25min；高甲醇40~60ml 20min；低甲醇80~100ml完全脱净 剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分

18 16.拍照并画电泳图谱，计算标准蛋白、待测样品的相对迁移率（蛋白相对迁移率＝蛋白迁移距离/指示剂迁移距离）。
17.用低分子量标准蛋白质所作的标准曲线，求待测样品亚基的相对分子量。 18.以标准蛋白质电泳的相对迁移率为横坐标(X)，标准蛋白质分子量的对数为纵坐标(Y)，绘标准蛋白质的标准曲线，再根据样品相对迁移率在曲线上求出其蛋白质的分子量。

19 蛋白名称 迁移距离 相对迁移率 （Y） 蛋白分子量 (D) 蛋白分子量对数(X) 兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白 牛碳酸酐酶 牛蛋白酶抑制剂 鸡蛋清溶菌酶 过柱的菠萝蛋白酶 指示剂 --

20 低分子量标准蛋白质的组分： 1) 兔磷酸化酶B 分子量 97,400 2) 牛血清白蛋白 分子量66,200 3) 兔肌动蛋白 分子量43,000 4) 牛碳酸酐酶 分子量31,000 5) 牛蛋白酶抑制剂 分子量20,100 6) 鸡蛋清溶菌酶 分子量14,400

21 八．实验注意事项 1.缓冲液的pH值、浓度要准确配置； 2.AP新鲜配置。 3.SDS在低温下析出，使用前水浴加热使之溶解。

22 九．实验结果分析 1. 各实验组分析讨论实验结果，再由老师进行归纳总结。 2. 做好电泳图谱的绘制及数据记录。
3. 学生对该实验有哪些体会。

23 4. 思考题： （1）电泳时，上下电泳槽产生的气体是什么？用过一次的电极缓冲液是否可以混合后再用？为什么？ （2）样品上样前为什么要沸水浴加热3～5分钟？ （3）SDS-PAGE是否需在低温下进行？为什么？ （4）做好本实验关键是什么？ （5）如果电泳图谱模糊，有些电泳带不出现或拖尾，试分析原因。