上饶师范学院 细胞生物学实验 主讲:林弘 张勇 上饶师范学院生命科学系 生物科学实验教学中心.

Presentation on theme: "上饶师范学院 细胞生物学实验 主讲:林弘 张勇 上饶师范学院生命科学系 生物科学实验教学中心."— Presentation transcript:

1 上饶师范学院 细胞生物学实验 主讲:林弘 张勇 上饶师范学院生命科学系 生物科学实验教学中心

2 目 录 1.实验一 细胞膜的渗透性 2.实验二 细胞凝集反应 3.实验三 线粒体的超活染色与观察 4.实验四 叶绿体的分离与荧光观察
上饶师范学院 目 录 1.实验一 细胞膜的渗透性 2.实验二 细胞凝集反应 3.实验三 线粒体的超活染色与观察 4.实验四 叶绿体的分离与荧光观察 5.实验五 线粒体的分离与观察 生物科学实验教学中心

3 实验一 细胞膜的渗透性 （2课时） 实验目的 1.了解细胞膜对物质渗透性的一般规律。 2.了解溶血现象及其发生机制。 上饶师范学院
实验一 细胞膜的渗透性 （2课时） 实验目的 1.了解细胞膜对物质渗透性的一般规律。 2.了解溶血现象及其发生机制。 生物科学实验教学中心

4 上饶师范学院 实验原理 细胞膜为一种半透膜，对物质的通透具有选择性。当红细胞放入低渗溶液中时，细胞吸水膨胀而发生溶血。 当红细胞放入含不同溶质的等渗溶液中时，由于细胞膜对不同溶质的透性不同，细胞发生溶血的时间也会不同，故发生溶血现象时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。 生物科学实验教学中心

5 上饶师范学院 实验操作 1．从集市买一只活鸡现杀取血5ml（防止污染），放入盛有20ml Alsever,s 液瓶中，混匀后置冰箱保存备用（2 周内使用）。 2. 使用前取用Alsever,s 液保存的新鲜鸡血5ml，加入8ml的0.128 mol/L 的NaCl 溶液，小心混匀，1000 r/min 离心5min，如此3 次洗涤，最后配成30%的鸡红细胞（CRBC）悬液。 3. 取11支试管，按附表中所示测试溶液，分别取样各3ml，作出标记后，各管均加入红细胞悬液2 滴，混匀后静置于温室中，观察各支试管中发生溶血的时间及其变化。 生物科学实验教学中心

6 观察结果 1. 试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（－），镜检红细胞完好呈双凹盘状。
上饶师范学院 观察结果 1. 试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（－），镜检红细胞完好呈双凹盘状。 2. 如果试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（＋或＋＋），镜检有部分红细胞呈碎片。 3. 如果试管内液体变红而透明者，称完全溶血（＋＋＋），镜检发现细胞全部呈碎片。 生物科学实验教学中心

7 实验建议 1. 鸡血在离心时，试管均需在扭力天平上平衡。 2. 目测红细胞体积或置于带刻度的离心管中，加入生理盐水配成30%的红细胞悬液；
上饶师范学院 实验建议 1. 鸡血在离心时，试管均需在扭力天平上平衡。 2. 目测红细胞体积或置于带刻度的离心管中，加入生理盐水配成30%的红细胞悬液； 3. 试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。 生物科学实验教学中心

8 实验报告及作业 上饶师范学院 生物科学实验教学中心 书写实验报告，并就细胞膜对不同物质的渗透性不同，对实验结果进行分析见表1。
目测法判断标准：快速溶血：＋＋＋；慢速溶血：＋＋或＋；不溶血：－ 生物科学实验教学中心

9 实验二 细胞凝集反应 （1课时） 实验目的 1. 观察血细胞的凝集现象。 2.掌握凝集素促使细胞凝集的原理。 上饶师范学院
实验二 细胞凝集反应 （1课时） 实验目的 1. 观察血细胞的凝集现象。 2.掌握凝集素促使细胞凝集的原理。 生物科学实验教学中心

10 上饶师范学院 实验原理 ①细胞质膜外表面的一层黏性多糖物质构成的细胞全委会被在细胞间的联系和识别、细胞的生长分化、免疫反应及肿瘤发生等过程中发挥着重要作用。 ②动物细胞表面的糖蛋白、糖脂中的糖链伸向膜表面，它们是细胞识别、细胞免疫及细胞接触抑制现象的必要组分。 生物科学实验教学中心

11 ④凝集素与糖分子结合有一定的专一性和结合价，并与细胞膜上受体的分布有关。
上饶师范学院 ③凝集素是一类含糖的(少数例外)并能与糖专一性结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果。 ④凝集素与糖分子结合有一定的专一性和结合价，并与细胞膜上受体的分布有关。 生物科学实验教学中心

12 上饶师范学院 实验操作 生物科学实验教学中心

13 上饶师范学院 实验报告 1.绘制简图，表示血细胞的凝集过程； 2.图示血细胞凝集的原理。 生物科学实验教学中心

14 实验三 线粒体的超活染色与观察 （3课时） 实验目的 1. 观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。
上饶师范学院 实验三 线粒体的超活染色与观察 （3课时） 实验目的 1. 观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。 2. 学习一些细胞器的超活染色技术。 生物科学实验教学中心

15 实验原理 ①活体染色：应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些细胞结构而又很少影响细胞生命活动的染色方法。
上饶师范学院 实验原理 ①活体染色：应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些细胞结构而又很少影响细胞生命活动的染色方法。 ②詹纳斯绿B：詹纳斯绿B能专一的对线粒体进行活体染色。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，即有色状态，呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。 生物科学实验教学中心

16 上饶师范学院 实验操作 1. 人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察 生物科学实验教学中心

17 上饶师范学院 清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上 ↓ 滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液 ↓ 用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞 ↓ 刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中 ↓ 染色10-l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液) ↓ 盖上盖玻片,显微镜下观察 生物科学实验教学中心

18 上饶师范学院 2. 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色观察 (1) 用脊椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织块，放入表面皿内。用吸管吸取Ringer 液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。 (2) 在干净的凹面载玻片的凹穴中, 滴加詹纳绿B 应用液，再将肝组织块移入染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体表面可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成(—般需染20～30min)。 生物科学实验教学中心

19 上饶师范学院 (3) 吸去染液，滴加Ringer溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴子载玻片上，盖上盖玻片进行观察。 (4) 在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有l～2 个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。 生物科学实验教学中心

20 上饶师范学院 3. 洋葱鳞茎表皮细胞线粒中的超活染色观察 (1) 用吸管吸取詹纳斯绿B 应用染液，滴一滴于干净的载破片上，然后撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10～15min。 (2) 用吸管吸去染液，加—滴Ringer液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。 (3) 在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据、细胞核被挤至—侧细胞壁处。细观察细胞质中线粒体的形态与分布。 生物科学实验教学中心

21 上饶师范学院 实验报告及作业 绘制口腔上皮细胞、洋葱鳞茎表皮细胞、小白鼠肝细胞中线粒体的形态与分布。 生物科学实验教学中心

22 实验四 叶绿体的分离与荧光观察 （3课时） 实验目的 1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
上饶师范学院 实验四 叶绿体的分离与荧光观察 （3课时） 实验目的 1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 2. 熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。 生物科学实验教学中心

23 上饶师范学院 实验原理 组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 生物科学实验教学中心

24 上饶师范学院 某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。 生物科学实验教学中心

25 实验操作 1.选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35mol/L氯化钠溶液15ml中置 组织捣碎机或研钵中。
上饶师范学院 实验操作 1.选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35mol/L氯化钠溶液15ml中置 组织捣碎机或研钵中。 2.利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆，3-5min，或研磨成匀浆。 3.用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。 4.取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。 生物科学实验教学中心

26 5. 将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。
上饶师范学院 5. 将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。 6.沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。 7.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察(荧光显微镜使用方法)时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片后即可观察。 8.观察叶绿体的形态结构、测量1-5个叶绿体的长轴和短轴、叶绿体发射荧光的现象。 生物科学实验教学中心

27 观察结果 1. 在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
上饶师范学院 观察结果 1. 在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 2. 叶肉细胞呈长方形或类方形，内含有大量带有绿色的叶绿体颗粒细胞，后者有时呈单一或多个排列。另外，视野下还可见到大量散在的点状或类圆状叶绿体颗粒。 3.加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。 生物科学实验教学中心

28 实验建议 实验报告及作业 1. 植物组织匀浆后要悬浮在等渗介质中进行差速离心；同时叶绿体的分离最好在0～4℃的条件下进行。
上饶师范学院 实验建议 1. 植物组织匀浆后要悬浮在等渗介质中进行差速离心；同时叶绿体的分离最好在0～4℃的条件下进行。 实验报告及作业 1. 画出分离后的细胞组分（注明形态的放大倍数）。 2. 分离细胞组分时，为什么要加入0.35mol/L 氯化钠？ 生物科学实验教学中心

29 实验五 线粒体的分离与观察 （3课时） 实验目的 1. 初步掌握用差速离心法分离玉米细胞线粒体的方法。
上饶师范学院 实验五 线粒体的分离与观察 （3课时） 实验目的 1. 初步掌握用差速离心法分离玉米细胞线粒体的方法。 2. 学习并掌握高速离心机的使用方法。 生物科学实验教学中心

30 上饶师范学院 实验原理 线粒体(mitochondria)是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 生物科学实验教学中心

31 上饶师范学院 制备线粒体时，可将组织匀浆液悬浮在悬浮介质中进行差速离心法进行分离。在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），大小不一的颗粒沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一个均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 生物科学实验教学中心

32 上饶师范学院 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在—定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。 生物科学实验教学中心

33 上饶师范学院 实验操作 1. 玉米种子用20%次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水冲洗30min，再浸泡清水15h。将种子平铺在放有湿纱布的盘内，保持湿度，置温箱28℃于暗处培育2~3d。待芽长到1-2cm长时剪下约15g，放0-4℃1h。 2. 加3倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆。 生物科学实验教学中心

34 3.用多层纱布过滤，滤液经700×g离心10min。除去核和杂质沉淀。
上饶师范学院 3.用多层纱布过滤，滤液经700×g离心10min。除去核和杂质沉淀。 4.取上清液10000×g离心10min，沉淀为线粒体。再同上离心洗涤一次。 5.沉淀为线粒体，可存于0.3mol/L甘露醇中。注意以上匀浆化及离心均控制在0-4℃进行。 生物科学实验教学中心

35 上饶师范学院 观察结果 线粒体的观察：取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上，不待干立即滴加1%詹纳斯绿B染色20min，放上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。 生物科学实验教学中心

36 实验建议 实验报告及作业 注意尽可能先充分研磨，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。最好在在0～4℃或冰浴中进行。
上饶师范学院 实验建议 注意尽可能先充分研磨，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。最好在在0～4℃或冰浴中进行。 实验报告及作业 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进行？ 生物科学实验教学中心