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实验三 重金属对鱼肝脏过氧化氢酶的影响
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一、 实验目的 （1）了解重金属影响抗氧化酶活性的机制 （2）掌握过氧化氢酶活性和蛋白质浓度的测定方法 一、
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二、实验原理 重金属进入生物体后可发生氧化还原反应，伴随有大量自由基的产生。过量的自由基可攻击生物大分子，引起DNA损伤、蛋白质破坏、脂质过氧化等，进而导致机体产生病变。
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生物体内的抗氧化体系（包括抗氧化酶和抗氧化剂）可起到清除过量自由基的作用，保护机体免受自由基的氧化损伤。
抗氧化酶系统包括超氧化物歧化酶（ SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶 （GSHPx）、过氧化氢酶（CAT ）等 抗氧化剂包括维生素C、维生素Ｅ、谷胱甘肽、硒和胡萝卜素等
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抗氧化酶活性和抗氧化剂含量的变化可以间接地反映出生物体内自由基水平的变化。因此在环境监测、生态毒理学等方面，过氧化氢酶作为一项重要指标得到广泛应用
测定过氧化氢酶活性可采用测压法、滴定法和分光光度法，其中以分光光度法最为简便，最为常用。其原理是在波长240nm处测定未被催化分解的过氧化氢，从而计算出被催化分解的过氧化氢量，以此测出过氧化氢酶活性。
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三、 实验步骤 （1）组织处理 1、取样：每组取一条重金属染毒后的金鱼，记录污染物和浓度，解剖，取出肝脏，用双蒸水洗净，擦干。若肝脏难以识别，取整个内脏团。 2、匀浆：按1g 肝重加12.5mL 匀浆缓冲液的比例加入缓冲液，在冰水浴（4℃）下用玻璃匀浆器匀浆，匀浆过程始终保持冰浴，尽可能彻底。 3、离心：将匀浆液移入离心管离心，转速5000g，时间10min，所得上清液用于过氧化氢酶活性测定。
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（2）活性测定： 在室温条件下，用紫外分光光度计测定过氧化氢酶活性。参比池为0.01mL 酶样 + 3.0mL 磷酸缓冲液，以此调零。样品池为0.01mL酶样 +3.0mL 反应液，混合后迅速放入槽中，盖上盖子。当吸光值开始明显下降的时候，按动秒表，同时记录当时的数值，随后每10sec 读取一次数值，连续记录1min。分别测定对照组和污染组金鱼肝脏过氧化氢酶活性。 *对照组即清水鱼样品由老师提供
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（3）蛋白质含量测定： 1、标准曲线绘制：以1mg/mL牛血清白蛋白为标准蛋白。取六支试管，按下表加入试剂。充分混合1min后，在595nm处测定吸光值。以蛋白质含量为横坐标，A595为纵坐标，绘制标准曲线。 试管编号 1 2 3 4 5 牛血清白蛋白（μl） 10 20 30 40 50 蛋白质显色液 （mL） 蛋白质含量（μg）
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2、样品蛋白质含量测定： 吸取适量酶样（10~50μl），与4mL蛋白质显色液混合后测定吸光值，若所得数值不在标准曲线范围内，需调整稀释度重新测定。利用标准曲线计算酶样中蛋白质浓度。
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（4）酶活性计算 一个单位的过氧化氢酶活性定义为：在25℃，100S内使H2O2分解一半时的酶蛋白含量。因此，酶活性单位与一级反应的半衰期有关，半衰期=ln2/K，半衰期与酶活性关系为： Activity（Unit）=100（s）/半衰期=100K/ln2 用紫外分光光度计测定H2O2在0~60s内不同时刻的吸光度A240，求得lnA240-t直线的斜率，即为反应速度常数K。
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由于不同酶样蛋白质含量不同，得到的酶活性必须用蛋白质含量校正：
Activity（U·g-1-Pr）=Activity（U）×105/Cprotein（mg/mL）
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实验报告 比较对照组和污染组的酶活性是否不同？可能的原因是什么？
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