實驗目的 掌握甲醛滴定法測定胺態氮含量的原理和操作要點 鑑定果汁成分，. 蔬果汁中甲醛態氮之測定 (電位滴定法) Determination method for amino nitrogen content in fruit juice page 66.

Presentation on theme: "實驗目的 掌握甲醛滴定法測定胺態氮含量的原理和操作要點 鑑定果汁成分，. 蔬果汁中甲醛態氮之測定 (電位滴定法) Determination method for amino nitrogen content in fruit juice page 66."— Presentation transcript:

1 蔬果汁中甲醛態氮之測定 (電位滴定法) Determination method for amino nitrogen content in fruit juice page 66

2 實驗目的 掌握甲醛滴定法測定胺態氮含量的原理和操作要點 鑑定果汁成分，

3 原理 加入甲醛溶液於胺基酸雙性離子樣品中，其與胺基酸的非解離型胺基反應，形成羥甲基衍生物[單羥甲基(-NH-CH2OH)和二羥甲基(-N(CH2OH)2 )等]，加入的甲醛固定住胺基的鹼性，使羧基顯示出酸性，此反應完全定量進行會釋放氫離子，此時以NaOH標準溶液滴定-NH3+基上的H+，每釋放一個H+，就相當有一個胺基氮。 (或完全中和-COOH基時的pH值為8.4~9.2) ，根據pH計指示的pH值判斷和控制滴定終點依鹼液消耗之體積換算為百分率，即為甲醛值，甲醛值乘以1.4即為甲胺基氮（甲醛態氮Formaldehyde-nitrogen）之量。 根據胺基酸的兩性作用，用氫氧化鈉標準溶液滴定，。其離子反應式如下：

4 器材 (一) 電子式分析天平(靈敏度為0.1mg) 一台 (二) 滴定管(50mL) 一支 (三) 滴定管架(白色底座) 一台 (四) 小漏斗(直徑5cm) 一個 (五) 燒杯(50mL) 一個 (六) 電磁攪拌器附滴定管夾 (七)pH度計：直接讀數，測量範圍0～14 pH，精度 ± 0.1 pH。

5 材料及藥品 柳橙汁(或芭樂汁) ： 100 mL 37%甲醛 pH7.00 標準液 pH10.00 標準液
0. 1N NaOH 標準液(須知力價) 0.01N NaOH 標準液(須知力價)

6 試樣的製備 一、濃縮蔬果汁 二、果汁固體飲料 在濃縮蔬果汁中 加入與在濃縮過程中失去的天然水分等量的水，使其成為果汁 並 充分混勻
供測試用。 二、果汁固體飲料 稱取約125g（精確至0.001g）試樣 溶解於蒸餾水中 將其全部轉移到250mL容量瓶 中 用蒸餾水稀釋至刻度 充分混勻

7 試樣的製備 三、含有碳酸氣的蔬果汁飲料 四、蔬果原汁及蔬果汁飲料 將試樣充分混勻，直接測定。 稱取500g試樣 在沸水浴上加熱15min
不斷攪拌 使二氧化碳氣體盡可能排除去 冷卻後 用水補充至原體積 充分混勻 供測試用。 四、蔬果原汁及蔬果汁飲料 將試樣充分混勻，直接測定。

8 測定步驟 校正pH計 預熱10min 用4.01的緩衝溶液校正pH計。 再用6.86的緩衝溶液校正pH計。 甲醛溶液(臨用前配):
將25 mL甲醛(37%)以 0.l N 氫氧化鈉溶液調整為 pH 値約為6-7。 在以0.01N NaOH 調整至 8.1。

9 取燒杯加入 25 g 樣品於150 mL 燒杯中，以 0. l N氫氧化鈉溶液調整至適當pH値8
取燒杯加入 25 g 樣品於150 mL 燒杯中，以 0.l N氫氧化鈉溶液調整至適當pH値8.1，加入 10 mL蒸餾水(取代甲醛溶液)，當做空白試驗。滴定至8.1，滴定數為b毫升。 稱取樣品約 25 g 於150 mL 燒杯中，以 0.l N氫氧化鈉溶液調整至適當pH値8.1，加入 10 mL甲醛溶液，磁石攪拌3分鐘。 以 0.0l N 氫氧化鈉滴定至終點，紀錄所需氫氧化鈉滴定量，滴定數為a毫升 樣品須做二重覆。

10 0.1 NaOH溶液滴定至pH 8.1(保持1min不變)
測定步驟 錐形瓶編號 試劑 樣品1 樣品2 空白 樣品（g） 25 25g 0.1 NaOH溶液滴定至pH 8.1(保持1min不變) 約16mL 中性甲醛溶液 pH 8.1（ml） 10 10 mL蒸餾水 0.01N 氫氧化鈉標準溶液滴定至pH 8.1 體積(a mL) 約15mL 體積(b mL) 甲醛態氮(mg/100g)= 公式 a：加入中性甲醛溶液後，滴定試樣消耗0.01mol/L氫氧化鈉標準滴定溶液的體積(mL) b：空白滴定體積(mL)

11 滴定結果紀錄表 加甲醛前耗NaOH 量 (mL )(A) 加甲醛後耗NaOH量 (mL)(B) NaOH標準液濃度 (mol.L-1) 樣
品 滴 定 1 2 平均 空 白 1.第一次滴定(A)是除去其它游離酸，所消耗的NaOH溶液體積不用於計算胺基酸態氮，但可計算總酸含量）。 2.第二滴定(B)才是測定胺基酸，用消耗的NaOH溶液體積進行計算。

12 計 算 甲醛態氮(mg/100g or100 mL)= 每100g(或100mL)試樣中甲醛態氮的毫克數(mg/100g或mg/100mL); a：加入中性甲醛溶液後，滴定試樣消耗0.01 mol/L 氫氧化鈉標準滴定溶液的體積(mL) b：空白滴定體積(mL) F： 0.01N氫氧化鈉標準滴定溶液的力價 0.14(mg-N/mL)：1 mL 0.01N氫氧化鈉標準滴定溶液相當於氮的毫克數。 允許差 同一樣品的兩次測定結果之差： 樣品之胺基態氮≥10mg/100g，不得大於2%； 胺樣品之基態氮<10mg/100g，不得大於5%。

13 適用範圍 本法適用於濃縮果蔬汁、果蔬原汁、果蔬汁飲料及果蔬汁固體飲料。

14 說明及注意事項 1、此法適用於測定食品中游離的胺基酸，胺基酸的含量一直是某些發酵產品如調味品的品質指標，也是目前許多保健食品的品質指標之一，其中的含氮量可直接測定，不同於蛋白質的氮，故稱為胺基酸態氮。胺基酸態氮反映的是樣品中游離胺基酸的總量。 2、固體樣品應先進行粉碎，準確稱取後用水萃取，萃取可在50℃水浴中進行0.5h即可。液體樣品可直接進行測定。 3、對於混濁和色深樣液可不經處理而直接測定。或用電位滴定法進行測定。若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色後再測定， 4、與本法類似的還有單指示劑（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用標準鹼完全中和-COOH時的pH為8.5~9.5，但分析結果稍偏低，即雙指示劑法的結果更準確。

15 說明及注意事項 本法準確快速，可用於各類樣品游離胺基酸含量測定 若樣品中只含有單一的已知胺基酸，則可由此法滴定的結果算出胺基酸的含量。
利用甲醛滴定法可以用來測定蛋白質的水解程度。隨著蛋白質水解度的增加，滴定值也增加，當蛋白質水解完成後，滴定值不再增加。 若樣品中含有多種胺基酸（如蛋白質水解液），則不能由此法算出胺基酸的含量。 影響滴定之因素 水溶液中的胺基酸在接近中性的水溶液中，全部解離為雙性離子，因而不能直接用鹼滴定胺基酸的羧基。 脯胺酸與甲醛作用後，生成的化合物不穩定，導致滴定後結果偏低。 酪胺酸含酚基結構，導致滴定結果偏高。

16 參考資料 甲醛態氮一般是用以檢驗果汁的純度，其檢驗方法可參考CNS 12630「水果及蔬菜汁飲料檢驗法-甲醛態氮之測定」。
Beddows et al., 1979 C.G. Beddows, M. Ismail and K.H. Steinkraus, The use of biomelain in the investigation of fermentation, Journal of the Science of Food and Agriculture 11 (1979), pp. 379–388.

17 題目 甲醛法測定胺基酸含量的原理是什麼？ 為什麼氫氧化鈉溶液滴定胺基酸的—NH3+基上的H+，不能用一般的酸鹼指示劑？
在測定過程中為什麼要加入中性甲醛的作用是什麼？ 甲醛態氮主要是定量醬油中的：(A) 果糖衍酸 (levulinic acid) (B) 甲醛 (formaldehyde)(C) 脂肪酸 (fatty acid) (D) 胺基酸 (amino acid)

18 酸鹼度計構造及使用說明 能夠自行辨識五種標準溶液, pH 4.01, pH 6.86, pH 7.01, pH 9.18 ,pH LCD大型顯示幕 CFM鍵: 校正確認鍵 CAL鍵: 校正鍵 ▼℃:未接溫渡探棒手動調整溫度上或選擇緩衝液 ▲℃:未接溫渡探棒手動調整溫度下或選擇緩衝液 MR :上一測試記憶 MEM : 測試記憶鍵 COMM : 設定RS-232傳輸速度. RANGE : 切換PH / ORP 測試模式 ON/OFF : 開/關鍵 電源插座. PH或ORP電極接頭 參考電極接頭 溫度探棒接頭 重新設定鍵 RS-232電腦連接埠

19 pH校正程序--單點及雙點校正 在清潔的燒杯中, 分別倒入約4公分深的pH 7.0及pH 4.0(或pH 10.0)標準溶液. 儘可能使用塑膠燒杯, 以避免EMC的干擾. 若您測量酸性樣本, 第二組校正液請用pH 4.0標準液; 若您測量鹼性樣本, 則用pH 10.0作為第二點校正液. 為了較好的準確度, 每種校正液均使用兩個燒杯為佳. 第一個用來漂洗電極, 第二個才用來實際校正用. 將電極及溫度探棒安裝妥當後, 打開電源. 將電極前端約4cm置入pH 7.0標準溶液中. 並輕微攪拌. 溫度探棒應儘量靠近pH電極的薄膜玻璃頭. 按下CAL鍵. ”CAL” & “ “符號會顯示,螢幕右下方則指示正確校正溶液值. 用▲℃及▼℃選擇不同的校正溶液系統(PH 4.01,PH 6.86,PH 9.18). 此時 “ NOT READY “字樣於螢幕上閃爍. 直到螢幕出現 ”READY” 和 ”CFM”字樣時請按下CFM鍵確認. 即完成零點校正 【註】若您只想進行單點校正, 可按下CAL鍵離開校正模式. 然而, 哈納建議您進行下述的第二點(斜率)校正, 較為精確.

20 pH電極保養 pH電極薄膜頭應經常維持濕潤. 若因保存時間長,使用時測值不穩定, 容易漂移, 原因是pH電極薄膜頭脫水過乾造成. 使用後只要把pH電極薄膜頭浸在HI70300L電極保存溶液或pH 4.01緩衝液中。或使用前把pH電極薄膜頭浸在HI70300L電極保存溶液或pH 4.01緩衝液中時間在1～2小時即可. pH電極參考透析膜孔的堵塞是另一個常見的故障原因. 預防的方法是使用哈納儀器出品的一系列電極清潔液, 做例行性保養, 可以延長其使用壽命. 一般清潔: 浸入HI 7061一般清潔液中約30分鐘 蛋白質: 浸入HI 7073蛋白質清潔液中15分鐘 無機物: 浸入HI 7074無機物清潔液中15分鐘 油脂類: 以HI 7077油脂清潔液漂洗 重要事項: 在進行以上清洗程序後, 請務必使用大量去離子水(Distilled Water)沖洗電極, 並將電解液換新(使用膠質電解液之電極則不用換更). 並在HI 70300保存溶液中浸泡1小時後, 才可以恢復正常之測量.

21 常見的電極問題 讀數不穩: 原因為透析膜太髒或阻塞. 請依上述清潔程序處理. 或為電極內之電解填充液太低所致. 單透析膜電極請用HI 7071, 雙透析膜電極請用HI 7082電解液(僅可重裝電解液型電極適用). 薄膜頭或透析膜太乾燥: 浸泡在HI 70300保存液中至少1小時. 讀數亂跳: 將電極前端浸泡於約50-60℃的HI 7082溶液中約1小時, 再以大量去離子水沖洗. 並更換其電解填充液. 單透析膜電極請用HI 7071, 雙透析膜電極請用HI 7082電解液(僅可重裝電解液型電極適用).

22 酸鹼度的測量 在開始測量前,先確定完成pH校正程序(詳見後述). 打開儀器電源. 預設模式即為酸鹼度測量.
測量酸鹼度十分的簡單, 僅需將pH電極及溫度探棒前端浸入待測樣本深約4cm. LCD顯示幕中, 右下方為溫度, 中間為酸鹼度值. 使用自動溫度補償(ATC)時,溫度探棒應儘量接近pH電極的薄膜玻璃頭, 其結果較正確. 哈納建議您: 在每次的測量前, 先使用該待測溶液漂洗電極, 可加快電極的反應速度, 以及減少樣本液的交互污染.

23 手動溫度補償 未接溫度探棒的情況下,螢幕中的” ℃ ”會呈閃爍狀.當溫度探棒未被連接時, 可使用哈納的或其他準確的玻璃溫度計來測量被測樣本的溫度. 以▲ & ▼ 鍵輸入該溫度值即可

24 pH校正程序 單點及雙點校正 接著螢幕提示將電極放入第二組校正液中(PH 4.01 或 PH 10.01)
如果您使用了錯誤的標準溶液, 在左方的螢幕會顯現 ”WRONG” 的符號. 將電極前端約4cm置入pH 4.0(或pH 10.0)標準溶液中. 並輕微攪拌. 溫度探棒應儘量靠近pH電極的薄膜玻璃頭. 此時 “ NOT READY “字樣於螢幕上閃爍. 直到螢幕出現 ”READY” 和 ”CFM”字樣時請按下CFM鍵確認. 即完成斜率校正