第四章      基因文库的建立  .

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1 第四章      基因文库的建立

2 基因文库(gene library) 基因组文库(genomic library) cDNA文库(cDNA library)

3 第一节 基因组文库的构建

4 一. 基因组文库的规模 二．建立基因组文库的一般程序 定义： 含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。
N—基因组文库克隆总数 P—所需机率 N= f—插入片段与基因组DNA长度之比 二．建立基因组文库的一般程序 1．载体DNA片段的制备 DNA分离纯化 限制酶切 脱磷酸化反应 2． 供体DNA片段的制备 总DNA分离纯化 机械剪切法 分离特定大小DNA片段 酶法 部分酶切 分离特定大小DNA片段 完全酶切 ln（1-P） ln（1-f）

5 2）重组频率----频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。
3. 供体与载体DNA连接 要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种DNA分子的克分子比率。 4. 重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增 利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生变化） 5. 基因组文库质量的评价 1）文库规模----随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。 2）重组频率----频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。

6 三.  利用质粒载体 构建基因组文库 该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。

7 四. 利用λ载体构建基因组文库 控制克分子比率，使其形成串状DNA分子 1. 载体DNA片段的制备方法: 左右臂DNA片段的获得
四.  利用λ载体构建基因组文库 1. 载体DNA片段的制备方法: 左右臂DNA片段的获得 2. 供体DNA片段的制备:限制酶部分酶切，机械剪切法 3. 重组DNA分子的形成： 控制克分子比率，使其形成串状DNA分子 4. 重组DNA分子的包装 1） λDNA的包装物的制备 使用的大肠杆菌菌株： E.coli BHB2688(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Eam Sam/λ])-包装蛋白 E.coli BHB2690(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Dam Sam/λ])-头部蛋白

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9 5. 基因组文库的扩增 ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单，本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
包装的λ颗粒 感染E.coli 培养 分离λ颗粒 ℃保存

10 五. 利用COS质粒载体构建基因组文库 1. 双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体 为提高文库质量，可采取以下措施：
构建过程与λ载体构建过程相似: 两臂DNA片段的制备，供体DNA片段的制备，两DNA的连接和重组DAN分子的包装。单COS质粒载体和双COS质粒载体构建基因组文库。 为提高文库质量，可采取以下措施： 1. 双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体 2. 供体DNA脱磷酸化以避免供体DNA间的连接导致重排 3. 载体和供体DNA末端修饰以避免上述两种情形发生 载体DNA XhoI or SalI酶切 补CT 连接 重组DNA 供体DNA Sau3AI部分酶切 补AG 4. 采用文库快速构建法以避免扩增文库时DNA丢失

11 利用单COS质粒载体文库

12 利用双COS质粒载体 构建基因组文库

13 1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心
构建过程也与λ载体构建过程十分相似: 1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2.  供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3.  两DNA的连接和重组DAN分子的包装 1)   包装物制备用菌株: E.coli NS3208[=MC1061, supo recD1014 hsdR- hsdM+ mcrA- mcrB- (P1 r-m- cm-2 c1.100 am10.1)] : 制备pacase E.coli NS3210[=MC1061, supo recD1014 hsdR- hsdM+ mcrA- mcrB- (P1 r-m- cm c1.100 am131)] : 制备头部蛋白 2) 重组DNA分子的包装与感染 与λ重组子包装相似, 然后感染E.coli NS3529 = E.coliK12 recA mcrA Δ(hsdR hsdM mcrB mcrC mrr)(λimm434 nin5X1-cre) (λimmλLP1), 每微克DNA可在Kanr平板上4 X X 106 Kanr。

14 利用P1载体 构建基因组文库

15 七. 利用YAC载体构建基因组文库 pYAC4 BamHI/EcoRI 脱磷酸化 1. 两臂DNA片段的制备: 2. 供体DNA片段的制备:
琼脂糖凝胶-DNA样品的制备 EcoRI部分酶切 脉冲场凝胶电泳 片段回收和纯化 3. DNA的连接 4. 重组DAN分子的转化: 原生质体转化法 5. 转化子的保存: 单菌落保存于96孔平板中

16 酵母人工染色体构建

17 第二节 cDNA文库的建立

18 一．cDNA文库的特点 定义：从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA经反转录成 cDNA后再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。
1. 基因特异性 常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：1—5% mRNA，80—85% rRNA，10—15% tRNA 2. 器官特异性 不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同

19 3. 代谢或发育特异性 4. 不均匀性 处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同
在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。 5. 各cDNA均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）

20 二. cDNA文库的规模 三. 建立cDNA文库的一般程序 2. 多聚（A）RNA的分离与纯化 3. 双链cDNA 的合成
N = f为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部cDNA （mRNA）分子数目之比 三. 建立cDNA文库的一般程序 1. 载体DNA片段的制备 2. 多聚（A）RNA的分离与纯化 3. 双链cDNA 的合成 1）单链cDNA 的合成：反转录法 2）第二条cDNA 的合成：碱解或酶解（RNaseH）法除去RNA分子 ln(1―p) ln(1―f)

21 4. ds- cDNA与载体DNA 相连 5. 重组cDNA分子的转移和文库的建立 3） cDNA的定向插入
1）人工接头：要求具平端ds- cDNA，酶切时可能导致某些cDNA链断裂 2）同聚物加尾：可大大减少载体DNA自身连接 3） cDNA的定向插入 5. 重组cDNA分子的转移和文库的建立 选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为λ载体，则需进行体外包装、感染等。

22 cDNA文库的构建

23 cDNA的定向插入

24 四. 建立cDNA文库的特殊方法 1. Okayama–Berg法 1）T引物的合成：在质粒上进行，用于合成第一条cDNA链
2）G引物的合成：在质粒上进行，用于合成第二条cDNA链 3）第一条cDNA链合成：T引物与mRNA退火 反转录反应 4）第二条cDNA链的合成： a. 第一条cDNA链3’-末端加尾（dCTP） b. 限制酶切除去载体上所加的多聚C尾巴 c. 与G引物退火 d. 除去RNA e. 合成第二条cDNA链 5）cDNA文库的形成—转化 该法的优点：获全长cDNA，并使cDNA表达的可能性提高一倍，因为cDNA插入方向与载体上启动子方向一致。

25 Okayama-Berg cDNA文库构建

26 2. Okayama–Berg改进法 该法集中了常规方法和Okayama–Berg法的优点，第一条cDNA链合成用常规法，但在3’-端加尾后，其余步骤与Okayama–Berg法相同

27 3. SMART(Switch Mechanism At the 5’ end of RNA Templates)方法
1) 当反转录酶合成到mRNA模板5’端后，它会在第一链的3’端加上几个C； 2) 合成的寡核苷酸G与C配对； 3）反转录酶以新合成的cDNA为模板，继续合成第二条cDNA链； 4）LD PCR—Long Distance PCR

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30 4．聚合酶链式反应法（PCR法） 采用TaqDNA聚合酶，方法是：变性 与引物复性 链延伸 下一个循环 1) 引物的合成：
T引物—5’-端富含GC，可提高退火温度，避免非特异性变性发生，因为3’-端含低聚dT G引物—5’-端富含AT，便于与载体相连，3’-端含低聚dG 2) cDNA的PCR扩增： 采用TaqDNA聚合酶，方法是：变性 与引物复性 链延伸 下一个循环 3) cDNA连接方式：用匹配接头

31 PCR法构建 cDNA文库