Oculina patagonica珊瑚伴生菌 生物系 赵闯营

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1 Oculina patagonica珊瑚伴生菌 生物系 赵闯营

2 摘要 通过分析从克隆文库和独立菌落中提取的16S rRNA基因，可以判定从白化的地中海Oculina patagonica珊瑚和岩洞生长的O. patagonica珊瑚组织和黏液中细菌的相对丰度。得出的结果也与先前发表的正常O. patagonica珊瑚的数据进行了比对。白化的、岩洞生长的、正常的珊瑚中细菌的菌落彼此完全不同。以序列相似性>99.5%标准表明，白化的珊瑚菌中316个克隆序列中的25%与不动杆菌属完全一致（100% identity)。岩洞生长的珊瑚菌中97个克隆序列的29%与从一种大珊瑚礁中提取的一种不可培养细菌有98%一致性。正常珊瑚优势菌则是灿烂弧菌。对珊瑚中分离的细菌用SYBR染色后表明，可培养细菌仅占总细菌的0.1-1%。从白化珊瑚、岩洞珊瑚和正常珊瑚中分离的能大量培养的细菌分别与Microbulbifer sp.、之前从正常珊瑚中分离的一种α-变形菌和一种α-原生菌序列最为接近。通过对O. patagonica珊瑚的研究我们得出以下三个结论： 1 珊瑚组织中细菌数量多与黏液 2 珊瑚组织中细菌种类与黏液中不同 3 由白化或缺少光照引起的无虫藻素共生的珊瑚伴生菌的种类与数量与正常相比会发生显 著改变

3 引言 对Oculina patagonica珊瑚白化和生态效应的研究已相当普遍。首次发现O.patagonica珊瑚是在1996年的地中海。目前，这种珊瑚在数万里的地中海水域栖息繁殖。除了在潮水坑，砂岩，暗礁栖息外，在无虫藻素生长的黑暗的岩洞中也能发现它们。 每年夏天都会发生O. patatonica 珊瑚的白化，从春末开始到海水温度达到30０C 的9月份达到高峰，9月中将有约90%的珊瑚白化。但这些珊瑚会在秋天和冬天恢复。在1995年研究报告声称，珊瑚白化是由shiloi 弧菌引起。从95年到2002年，对温度与珊瑚白化的关系也进行了大量研究。然而，2002年以来珊瑚开始对shiloi 弧菌产生抗性，无论在正常还是在白化的珊瑚中均无shiloi 弧菌存在。近来，攻毒实验表明，shiloi 弧菌先黏附与珊瑚表面，渗透进入珊瑚外胚层后被杀死。 实验表明虫藻素光合作用的产物是珊瑚营养的重要来源。越来越多的数据表明，与珊瑚伴生的细菌在正常和病态珊瑚中起重要角色作用。珊瑚与这些微生物存在着共生关系。珊瑚前生命期假说认为：当外界环境发生诸如，温度上升、微生物种类发生大的改变等情况时，珊瑚就会发生异变。本实验将对这一理论中的—当珊瑚遇到胁迫时体内细菌种群会发生改变这一假设进行验证。这种胁迫是由珊瑚白化引起的无虫藻素共生。得出的数据还将与由缺少光照引起的无虫藻素共生和正常珊瑚伴生菌进行比对。

4 实验材料与方法 样品采集 样品采集点Sedot Yam，位于地中海水域以色列海岸。其中三个白化的珊瑚碎片于2005年9月份采集，另两个则于2006年1月岩洞中采集。岩洞中采集的样品深度在1-3m，两采集点间距小于3m.样品采集后立即放入水中的塑料袋中带回实验室。 黏液的提取 将珊瑚破碎为2×2cm碎片后装入50ml离心管，2675g状态下离心3min，液体即为珊瑚黏液。离心后的碎片加入人工海水研磨，放置15min后，取漂浮物即为珊瑚组织。

5 细菌的分离及计数 DNA提取和16SrRNA基因的PCR
用提前准备的0.2um滤过的海水对珊瑚黏液和组织进行十倍连续稀释后，涂布于Marine Agar 2216 和TCBS两种培养基制备的平板上。涂平板后300C培养一周。对最高稀释倍数的菌落进行DNA分离。所有平板的细菌用SYBR Gold法进行计数。每个样品最少扫描10次 . DNA提取和16SrRNA基因的PCR 珊瑚的黏液和组织9300g离心15分钟，沉淀用 UltraClean Soil DNA Kit 提取DNA.对可培养细菌的DNA可用GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit 进行提取。进行PCR时，从菌落基因组中、海水中、珊瑚黏液样品中、珊瑚组织样品中提取的16SrRNA基因均用8F 和1492R引物。50-μl reaction（5 μl 10× buffer, 1 μl 2.5 mM total dNTP mixture, 5 μM　of each primer, 10 ng template DNA, and 2.5 units Ex Taq　DNA polymerase ） 解链：９５０C　３min 循环：９４０C　１min 55０C 1min 72０C 1min　（３０cycles） 复性: 72０C 10min PCR产物进行１％琼脂糖凝胶电泳分析。产物用ExoSAP-IT® (USB corp.).进行清洗。 链末端终止法对得到的DNA测序。测序反应所用引物是与16SrRNA基因保守互补的序列。

6 克隆文库的构建 将扩增的珊瑚黏液和组织DNA与pGEM®-TEasy Vector整合后转入大肠杆菌12s细胞。每一克隆都由M13正向和反向引物通过菌落PCR得到。PCR条件： 解链：950C 4.5min 循环：950C 0.5min C 0.5min 720C 1min (30 cycles) 复性：720C 10min PCR产物进行１％琼脂糖凝胶电泳分析。纯化和测序与上述相同。 序列分析 用 BioEdit 构建DNA距阵并用Clustal X进行排序。利用DOTUR将序列一致性>99.5%的序列归为一簇。序列中少于350bp的剔除不与分析。对所得的每一簇序列进行BLAST网上比对。

7 结果分析 与白化的和岩洞O.patagonica珊瑚伴生的可培养细菌数量与总细菌数量
在夏季，收集三个不同的白化的和两块岩洞O.patagonica珊瑚碎片。在分离DNA前将组织和黏液分开，这样可培养细菌和总细菌的数量就是一定的。表1对这两种珊瑚的伴生菌并和先前已知的正常珊瑚进行了对比。白化的和岩洞O.patagonica珊瑚组织中可培养的细菌无明显差异。正常珊瑚黏液的可培养细菌数量是它们的3-5倍，正常珊瑚组织的可培养细菌数量是它们的2倍。其中一种可培养的弧菌在白化的和岩洞珊瑚组织和黏液中的总数量几乎相同。正常珊瑚组织中这种弧菌的数量是它们的12倍以上，正常珊瑚黏液中分别是白化的2.5倍和岩洞珊瑚的4倍。珊瑚中可培养细菌仅占细菌总数的0.1-1%。整体而言：组织中的细菌数量比黏液中为多。正常珊瑚组织中细菌总量是白化珊瑚的5倍是岩洞珊瑚的16倍。正常珊瑚黏液中细菌总量与白化的珊瑚相当是岩洞珊瑚的2.5倍。

8 白化的O.patagonica珊瑚伴生菌 表2对从白化的O.patagonica珊瑚DNA克隆文库得到的序列进行16SrRNA鉴定的结果进行了统计。对316个序列分析表明，135个即43%出现了至少3次，在剩下的181个序列中，有38个序列出现了两次，143个序列出现了一次。因此，我们得到175种不同种类的细菌簇，因此该数据表明珊瑚菌种类相当多样化。在珊瑚组织和黏液中占主导的Acinetobacter sp.分别代表了克隆序列的15和32%。Acinetobacter sp.在三块珊瑚碎片中都有分布，甚至在一块碎片组织中占到了79%。 表3对从白化的珊瑚分离的菌落中得到的序列进行16SrRNA鉴定的结果进行了统计。这16簇细菌包含了全部可培养细菌总量的69%。这16簇细菌无一与表2（16SrRNA基因文库得到的序列）中种类一致。其中含量较多的第7簇只在组织样品中出现。分离的不同细菌的种类为58。

9 岩洞珊瑚伴生菌 表4总结了从岩洞珊瑚的组织和黏液提取的DNA细菌簇。其中5簇代表了黏液细菌数量的77%而7簇代表了组织细菌数量的29%，这表明组织中细菌的种类远比黏液中丰富。这十簇至少代表了总细菌种类的50%。在组织中相对较丰富（6%）的这种细菌簇与弧菌harveyi sp.相似。第十簇则占黏液细菌的56%和总细菌的30%。 表5对岩洞珊瑚可培养细菌种类进行了统计。这8簇包含了组织和黏液细菌总数的61%。第2簇是黏液中最丰富的（18%）但在组织中则没有。第5簇中则有组织菌落的26%和5%的黏液细菌。

10 讨 论 之前，我们描述了正常O.patagonica珊瑚组织和黏液细菌的种类和数量，包括410种可培养细菌的序列和678种不可培养细菌种类的序列。本文我们报道了白化的O.patagonica珊瑚伴生菌，包括161种可培养细菌和316种不可培养细菌及岩洞珊瑚中的108种可培养细菌的序列和97种不可培养细菌的序列。在研究白化的和岩洞珊瑚中得出以下结论： 1. 珊瑚组织和黏液中的细菌数量和种类均有所不同。组织中细菌数量远多于黏液中，可能是由于组织有不同的生境。现在还不确定是哪些细菌分布于组织的表面，哪些分布于组织的内部。整体上讲，细菌在组织和黏液中是不同的。有一些细菌只在黏液中存在而有些则只存在与组织中。过去对珊瑚伴生菌的研究主要集中与黏液菌而不是组织中的细菌。很明显，当我们研究珊瑚微生物时应当二者兼顾。当把石内生存的微生物也考虑进来的话，O.patagonica珊瑚伴生菌的数量和种类将远比我们报道的要多。

11 2. 有超过99%的珊瑚菌在只有MB琼脂培养时处于能养活但不能培养（viable-but-not-culturable）的状态
2. 有超过99%的珊瑚菌在只有MB琼脂培养时处于能养活但不能培养（viable-but-not-culturable）的状态.结果表明可培养细菌占总珊瑚菌的比例微乎其微。因此在由克隆文库得来的优势细菌中没有可培养细菌也就不为怪了。但也不排除是在DNA分离和PCR引物选择上的偏好性影响。 3. 总之，珊瑚菌种类和数量都相当丰富。一种解释就是“保险假说”，珊瑚需要大量的微生物以便应对环境改变所造成的影响。先前的研究对珊瑚伴生菌的多样性也有报道。 珊瑚的白化病不仅能引起虫藻素的缺失，而且导致珊瑚配子发育的终止、自我修复功能的丧失和生长缓慢。岩洞珊瑚配子发育能正常进行。白化的珊瑚处于病理和胁迫状态而岩洞珊瑚虽同样缺少虫藻素但仍处于正常状态。对白化的和岩洞O.patagonica珊瑚伴生菌进行比较表明：它们的种属差别显著。在白化珊瑚中大量存在的一种普遍认为是陆地种群的Acinetobacter sp.在其它珊瑚中偶尔也能找到。由于我们没有分离到可培养的代表Acinetobacter sp.细菌簇，因此目前我们还不能确定它是否与白化有关。在岩洞珊瑚中分离的优势菌，经16SrRNA序列测定与从海底沉淀物中分离的一种尚未分类的不可培养细菌极为相似。由于没有光合作用的产物，这些无虫藻素共生的珊瑚伴生菌可能从海水中获取能量。总的来说，岩洞珊瑚伴生菌在珊瑚组织中的多样性大于其黏液中的多样性，而白化的珊瑚中则恰恰相反。这可能是由于白化的珊瑚是处于疾病状态，而岩洞珊瑚则是为了适应缺少虫藻素带来的能量约束方式。

12 与正常珊瑚相比，白化珊瑚和岩洞珊瑚的黏液层和组织层均较薄，无氧呼吸速率也较低。我们的数据还表明与正常珊瑚相比，二者组织中伴生菌总量也偏少。这说明正常珊瑚组织伴生菌对虫藻素光合作用产物相当依赖。很明显，由于虫藻素的缺失也引起了优势菌的巨大改变。值得说明的是三种样品的采集是在不同时间进行的，这可能会对结果造成影响，但是，灿烂弧菌的缺失却不是由于采样的时间和温度的改变引起的，因为在正常珊瑚中无论是夏天还是冬天采集的样品中，灿烂弧菌都是优势菌。需强调的是O.patagonica珊瑚是一种温和型珊瑚，不能在珊瑚暗礁中生存。因此我们有兴趣知道我们得出的结论是否与珊瑚暗礁中的珊瑚一致。我们以Agaricia珊瑚为研究对象发现，一种弧菌在珊瑚白化时增多，而白化的珊瑚恢复过程中该菌也随之减少。 珊瑚前生命期假说认为，共生菌与外界条件存在一种动态关系，使珊瑚能处于一种有利的状态。通过改变微生物的种类和数量，比让珊瑚菌发生突变，使珊瑚能更快的适应环境的变化。我们的研究，相同的珊瑚在不同环境条件下有不同的种群，也在一定程度上支持了该假说。

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