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第三章 蛋白质的结构与功能
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蛋白质的分子结构包括 高级结构 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure)
三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure) 高级结构
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3.3 蛋白质的一级结构 一、肽键和肽平面 1. 肽键的定义： 一分子氨基酸的α-氨基与另一氨基酸的α-羧基之间脱水形成的酰胺键称为肽键。
2. 肽的定义： 若干氨基酸之间以肽键相连接所形成的长链称为肽。
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肽键 氨基酸残基
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3.肽平面（肽基） 肽键中的四个原子和它相邻的两个Cα称为肽基 肽基中的六个原子处于同一平面，形成了酰胺平面，也称肽平面。
肽键的键长介于单、双键之间，具部分双键的性质，不能自由旋转。 (3) 在肽平面中C=0与N-H呈反式。
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蛋白质分子中氢键的形成
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（一）肽单元 参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。
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肽平面（peptide plane）——即酰胺平面（amide plane）由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元。
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二、肽结构的表示 多肽链的一端含游离的-氨基，称为氨基端或N-端；另一端含游离的-羧基，称为羧基端或C-端。
肽表示方法：从N-端开始，以C-端为终点，用三字符号表示。如Ser·Val·Tyr·Asp·Gln
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天然存在的活性肽 活性肽：分子量比较小，游离状态存在，具有特殊的生理功能的多肽 含有自由的巯基， 例：谷胱甘肽（GSH）：
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可作为体内重要的还原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使其处于活性状态。
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H2O2 2GSH NADP+ GSH过氧化物酶 GSH还原酶 2H2O GSSG NADPH+H+
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2. 多肽类激素及神经肽 体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽(neuropeptide)
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生物的生长、发育、细胞分化、大脑活动、肿瘤病变、免疫防御、生殖控制、抗衰老、生物钟规律等均涉及到活性肽。它是机体内传递信息、调节代谢和协调器官活动的重要化学信使。
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三、蛋白质的氨基酸顺序具有特异性 -----蛋白质的一级结构
三、蛋白质的氨基酸顺序具有特异性 蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构定义： 指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序。 胰岛素
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测定前的准备工作： a、样品必须是均一的，纯度应在97%以上； b、已知蛋白质的分子质量，其误差允许在10%左右；
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四、蛋白质一级结构的测定
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主要步骤： 1. 多肽链末端氨基酸的测定 鉴定N端AA: Sanger法--DNFB （二硝基氟苯）反应 Edman法 鉴定C端AA ：
方法一：直接测序法 主要步骤： 1. 多肽链末端氨基酸的测定 鉴定N端AA: Sanger法--DNFB （二硝基氟苯）反应 Edman法 丹磺酰氯法 鉴定C端AA ： 肼解法 羧肽酶法
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（1）N端氨基酸残基鉴定 ①Sanger法 DNFB（二硝基氟苯）反应 DNFB DNP-肽链
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鉴定N端方法之② （DNS法）丹磺酰氯反应
-HCl + 氨基酸混合物 水解 DNS-氨基酸 DNS-肽链
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鉴定N端方法之③ Edman化学降解法（PITC法/苯异硫氰酸酯法）
特点 ： 能不断重复循环 PTC-肽链 薄层层析或纸层析鉴定
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(2) C 端氨基酸残基鉴定： ①羧肽酶法 是目前最有效也是最常用的方法。
据一定时间内释放出的AA的数量和种类来推测.
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②肼解法 多肽与肼共热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。 C-端氨基酸借DNFB转变成黄色的DNP－氨基酸，再抽提之并用层析法鉴定 注:末端若为Asn,Gln,Cys,Arg就不能用此法 1952年由Akabori提出的是目前最好的方法
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重要步骤原理— 2.多肽链的分离——获得单条线形多肽链 非共价键：变性剂如脲、盐酸胍 共价键 ：二硫键断裂—巯基乙醇
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胰岛素 -巯基乙醇 二硫键的断裂 碘乙酸
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1.酸水解：常用6mol/L HCl回流20h，水解完全，不引起消旋，但色氨酸破坏，羟基氨基酸部分水解，酰胺键水解。
3.多肽链的氨基酸组分分析 -----蛋白质的彻底水解 1.酸水解：常用6mol/L HCl回流20h，水解完全，不引起消旋，但色氨酸破坏，羟基氨基酸部分水解，酰胺键水解。 2.碱水解：水解完全，会引起消旋，但色氨酸不破坏。
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4.多肽链的专一性断裂 化学法：溴化氰（CNBr）裂解法 —专一性断裂Met羧基端的肽键
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酶解法 ：利用某些蛋白水解酶，进行选择性降解
胃蛋白酶：专一性低 胰蛋白酶：碱性氨基酸的羧基末端（Lys/Arg）。 胰凝乳蛋白酶：芳香族氨基酸的羧基末端 弹性胰蛋白酶：脂肪族氨基酸的羧基末端
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5. 测定每个片段的氨基酸顺序 蛋白质测序仪测序 ---Edman降解法
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6.由重叠肽段推断完整肽链序列 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。
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二硫键位置的确定 一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，
再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将“脱队”肽段进行组成及顺序分析。
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对角线电泳法
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方法二 ----通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 分离蛋白质对应的mRNA 经反转录测定cDNA的核苷酸序列
按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列
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蛋白质的二级结构
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一、X射线衍射技术
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X-Ray diffraction crystallography
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二、二级结构产生的原因 多肽链的主链由许多肽平面组成。
两相邻酰胺平面之间，能以共同的Cα为定点而旋转，其中Cα-C键旋转的角度称ψ，Cα-N键旋转的角度称φ。 ψ和φ这一对二面角决定了相邻两个肽平面的相对位置，也就决定了肽链主链的构象。
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三、蛋白质的二级结构 (一)、α-螺旋 1950年美国Pauling等人在研究纤维状蛋白质时，提出了α-螺旋。它是最常见，含量最丰富的二级结构元件
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二级结构 -螺旋 ( -helix) 稳定因素： NH与CO之间的氢键
Φ＝－57° ψ＝－47° 第n个CO与 第n＋4个NH形成氢键
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1.-螺旋的结构要点： ①-螺旋有左、右螺旋两种,天然蛋白质分子多为右手螺旋。
②每3.6个氨基酸残基螺旋上升一周,此纵向距离即螺距为0.54nm，即每个氨基酸残基沿中心轴上升0.15nm，旋转100°。
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③每个AA残基的-C=O基氧与其相邻的第四个残基的-NH-基氢形成氢键,即肽链内形成氢键。其取向几乎与中轴平行, -螺旋的稳定性主要靠此氢键维系；
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典型的α-螺旋用3.613表示：3.6为螺旋上升一圈包含的氨基酸残基数，13为氢键封闭环内的原子数。
非典型的α-螺旋还有3.010，4.416等。
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(2) β-折叠
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结构要点： 两条或多条几乎完全伸展的肽链/肽段平行排列 主链呈锯齿状折叠，侧链交替分布在片层平面两侧 相邻肽链主链上的NH和CO之间形成氢键， 氢键方向与肽链长轴接近垂直
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β-折迭是由若干肽段或肽链排列起来所形成的扇面状片层构象，其结构特征为：
⑴ 由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成片状结构； ⑵ 主链骨架伸展呈锯齿状； ⑶ 借相邻主链之间的氢键维系。
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β-折迭包括平行式和反平行式两种类型
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β-折叠的两种形式: 反平行式（更稳定） 平行式
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（3） β转角（ β turn/bend/hairpin structure）
肽链主链骨架180°的回折结构 特点： 由4个连续的AA残基组成 第一个残基C=O 第四个残基NH 形成氢键
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β-转角：
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β-转角（ U形转折,发夹结构）：是多肽链180°回折部分所形成的一种二级结构，其结构特征为：
⑴ 主链骨架本身以大约180°回折; ⑵ 回折部分通常由四个氨基酸残基构成; ⑶构象依靠第一残基的-CO基与第四残基的-NH基之间形成氢键来维系。 (4) 主要有两种类型：I 型和II型；二者主要差别是中央肽基旋转了1800， (5) 一些氨基酸如Pro、Gly经常出现在-转角中； II型-转角中的第三个氨基酸残基总是Gly。
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（４）无规则卷曲 是指多肽链主链上不能归入明确的二级结构的多肽区段。是一种非重复性结构。
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四.超二级结构（了解） １.超二级结构 1973年Rossmann提出的。指在蛋白分子中，由若干相邻二级结构单元组合彼此相互作用，形成有规则的在空间上能辨认的二级结构组合体。 三种基本组合形式：αα；ββ；βαβ；
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2. 丝心蛋白(fibroin)：这是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能拉伸。丝心蛋白是典型的反平行式-折叠片，多肽链取锯齿状折叠构象。
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3.4.2 蛋白质的三级结构 一、几个概念 1.三级结构：指一条多肽链借助各种次级键折叠成的具有特殊肽链走向的紧密构象。（三级结构的形成使得在序列中相隔较远的氨基酸侧链相互靠近） 维系三级结构主要作用力：疏水作用力、氢键、范德华力、盐键
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2.球状蛋白质三维结构的特征 含多种二级结构单元； 是紧密的球状或椭球状实体； 分子表面有一空穴(活性部位)；
β-折叠 β-转角 无规则卷曲 空穴 α－螺旋 含多种二级结构单元； 是紧密的球状或椭球状实体； 分子表面有一空穴(活性部位)； 疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面。
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3.结构域 结构域（domain）是1970年Edelman提出的，指多肽链在超二级结构基础上进一步绕曲折叠而形成的三级结构的局部折叠区。它是相对独立的紧密球状实体,具有部分生物学功能。
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结构域之间有一段柔性的肽链相连—铰链区，使结构域之间可以发生相对移动；结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用可体现出蛋白质的总体功能。
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二、多肽链的折叠和蛋白质的变性 （一）蛋白质变性
蛋白质变性：天然蛋白质受到某些过激的理化因素影响时，维持蛋白质高级结构的次级键被破坏，导致天然构象解体，生物活性丧失。 变性的因素： 强酸和强碱；有机溶剂；去污剂；还原性试剂如尿素、β-硫基乙醇；盐浓度，盐析、盐溶；重金属离子；温度；机械力。
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变性的实质： 次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。变性不涉及一级结构的破坏。 蛋白质变性后，往往出现下列现象： ①生物活性丧失------主要特征。 ②理化性质改变：溶解度降低、扩散系数降低，粘度增加，易被蛋白酶水解
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实际应用：A.消毒灭菌：75%乙醇，紫外线，高温。 B.制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。
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8 M urea and -mercapotoethanol
（二）氨基酸序列规定蛋白质的三维结构 1.核糖核酸酶变性与复性作用 Denative reduced ribonuclease Native ribonuclease 8 M urea and -mercapotoethanol 变性 Dialysis 复性 Native ribonuclease
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这个实验充分证明了蛋白质的功能取决于其特定的天然构象，而规定其构象所需要的信息包含在它的氨基酸序列之中。
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根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构(了解)
* 用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。 * 通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。
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二、肌红蛋白的结构与功能（Myoglobin）
哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质。 由一条多肽链（珠蛋白）和一个血红素辅基组成。 多肽主链由8段α-螺旋组成，分别命名为A、B、C…H， 血红素辅基扁平状，结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。
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在血红素辅基的氧结合部位一侧，还有另一个His残基（第64位），与氧分子能紧密接触。被结合的氧分子夹在His咪唑环N和Fe原子之间。氧结合部位是一个空间位阻区域。
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煤气中毒的机制 游离的铁卟啉结合CO比结合O2强25000倍，但肌红蛋白中血红素对CO的亲和力仅比O2约大250倍。这里CO的直线结合方式受到阻碍主要是远侧His的空间位阻造成的。 尽管如此，人体吸入少量的CO还是能完全抑制血红蛋白与O2的结合，从而造成缺氧死亡。 急救方法：尽快将病人转移到富含O2的环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧气），使与血红素结合的CO被O2置换出来。
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结论：多肽链折叠成天然构象是蛋白质执行独特功能的保证，蛋白质的高级结构决定蛋白质的功能。
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蛋白质的四级结构 一、有关概念 1.四级结构(quarternary structure)：指由相同或不同的称作亚基（subunit）的亚单位按照一定排布方式缔合而成的蛋白质结构。（亚基一般是一条多肽链，有时也称单体。本身具有球状三级结构。） 蛋白质的四级结构涉及亚基种类和数目以及各亚基或原聚体在整个分子中的空间排布，包括亚基间的接触位点（结构互补）和作用力（主要是非共价相互作用）。
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3.四级缔合在结构和功能上的优越性 1.增强结构稳定 2.提高遗传经济性和效果 3.使催化基团汇集在一起 4.具有协同性和别构效应
烟草花叶病毒外壳蛋白四级结构的自我组装
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二、血红蛋白 主要功能：在血液中结合并转运氧气。
红细胞成熟期间产生大量的Hb（含3亿个），Hb以高浓度溶于红细胞溶胶中。动脉血中Hb约为96%氧饱和度，静脉血中则为64%。向组织释放6.5mlO2/100ml血液。
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1.Hb的结构 成人的血红蛋白主要是HbA--由两个α亚基和两个β亚基组成的四聚体（α2β2）， 每个亚基含一个血红素辅基
接近于球体，α、β链的三级结构与肌红蛋白的很相似
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2.氧合作用 Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称氧饱和度）随O2浓度变化而改变。
肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧结合曲线
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别构效应: 在生物体内，当某种物质可特异地与蛋白质分子的某一部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化，这种现象称别构效应。 协同效应： 血红蛋白分子中亚基间的别构效应存在促进关系，即寡聚蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能促进此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。
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血红蛋白与氧的亲和力很弱，但当氧与血红蛋白分子中一个亚基的血红素铁结合后。即引起该亚基构象的改变，一个亚基构象的改变又会引起其余亚基的构象相继发生改变，亚基间的次级键被破坏，结果整个分子从紧密的构象变成比较松散的构象，易于与氧结合，使血红蛋白与氧结合的速度大大加快。
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三、一级结构的变异对功能的影响 例：分子病 镰刀状红细胞性贫血—血液中出现大量镰刀状红细胞，患者因此缺氧窒息
它是最早认识的一种分子病。流行于非洲，死亡率极高，大部分患者童年时就夭折，活过童年的寿命也不长，它是由于遗传基因突变导致血红蛋白分子结构的突变。
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血红蛋白分子结构的突变： 保守序列或保守氨基酸改变，功能改变；
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分子缔合的基础 谷氨酸(极性) 缬氨酸(非极性)
谷氨酸(极性) 缬氨酸(非极性) 由于缬氨酸上的非极性基团与相邻非极性基团在疏水作用力下相互靠拢，血红蛋白形成纤维沉淀，沉淀压迫细胞膜，使它弯曲成镰刀状。 一级结构变化有时会引起三维构象发生显著变化，并引起蛋白质功能的变化！
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结构与功能的关系 一级结构决定蛋白质的高级结构 高级结构直接决定蛋白质的生理功能
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