实验十二、细胞核与线粒体的分级分离 (差速离心法与密度梯度离心)

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1 实验十二、细胞核与线粒体的分级分离 (差速离心法与密度梯度离心)
一、实验目的： 1. 初步了解细胞内各种成分的分离方法； 2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法； 3、对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。

2 二、实验原理 细胞器分离基本步骤 细胞破碎 分离、纯化 细胞器鉴定 （一）细胞破碎的方法 1.杆状玻璃匀浆器法 2.高速组织捣碎机法
3.超声波处理法 4.化学裂解法 5.反复冻融法

3 细胞破碎的注意事项： 1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液（0
细胞破碎的注意事项： 1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液（0.25mol/L ）。它比较接近细胞质的分散相，具有足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小，在pH 的条件下细胞器不易发生聚集。 2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。 3、若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长，导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。

4 二、实验原理 （二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术。 离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。 主要包括差速离心、密度梯度离心等方法。

5 差速离心法 (Differential centrifugation)
根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别，分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方法。从低速到高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降系数相差较大（10倍及以上）的颗粒。

6 9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器)
Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 1st Step: Differential centrifugation Pellet (颗粒团) Supernatant (上清液) Figure Differential centrifugation is a common first step in fractionating a cell homogenate (细胞匀浆 ). 沉降顺序：细胞核—线粒体,溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高尔基体—核糖体。

7 差速离心法 (Differential centrifugation)
优点：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。 缺点：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；须经反复悬浮和离心加以纯化； ②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀； ③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。

8 9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器)
Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 2nd Step: Density-gradient centrifugation Figure A mixed-organelle fraction can be further separated by equilibrium density-gradient centrifugation. 常用介质(高溶解性的惰性物质): 氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖

9 密度梯度离心 （Density-gradient centrifugation）
当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，线粒体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。

10 三、实验材料及用品： 器具：高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、组织捣碎机，培养皿，离心管 1500/21000rpm
（五楼实验室） 2700/12800rpm

11 试剂：生理盐水、 mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、 mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 4.1.0 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5. 5.1.5 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5 6. 固定液【甲醇-冰乙酸(9:1)】、姬姆萨染液(Giemsa) 7. 1%詹纳斯绿B染液(Janus Green染液)。 材料：动物肝脏(蛙肝)。

12 ⑵ 加入10mL预冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液
四、实验方法与步骤： 1. 动物肝细胞匀浆制备： ⑴ 取出肝脏（2g左右），先用清水冲洗干净后，放在置于冰块上的培养皿中用剪刀剪成小块，去除结缔组织，用生理盐水反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 ⑵ 加入10mL预冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液 ⑶将悬浮的肝组织液倒入组织捣碎机中进行捣碎，直至没有可见的组织块为止。 (4)将肝组织捣碎液分装在50ml离心管中， 1500rpm 4 °下 （位于五楼的实验室）离心 2min (去除大组织块） 如缓冲液里面加有Ca2+，钙离子能够促进质膜碎片的聚集

13 注意事项： 尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间， 整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。

14 2. 细胞核与线粒体的分离（两人一组）： ⑴ 先将0.5mL 0.34mol/L蔗糖缓冲液放入1.5ml离心管，然后沿管壁小心地加入0.5mL肝组织匀浆使其覆盖于上层。 rpm 4 °下离心10min，沉淀为粗提的细胞核。 ⑵ 将上清缓缓取出转入另一个离心管中，沉淀用1mL预冷的0.25mol/L蔗糖缓冲溶液洗1次 (2700rpm离心10min)，离心管中的沉淀为细胞核与部分细胞碎片。 需要提醒学生正确使用移液枪

15 (4) 去一支1.5ml离心管，先加入0.4ml 1.5 mol/L 的蔗糖溶液，
差速离心分离线粒体（一位同学完成） ⑶ 将上一步得到的上清液12800rpm离心10min，沉淀即为粗提的线粒体。（如果沉淀足够多，也可以用1mL预冷的0.25mol/L蔗糖缓冲溶液洗1次 (2700rpm离心10min)，获得线粒体） 密度梯度离心分离线粒体（一位同学完成） (4) 去一支1.5ml离心管，先加入0.4ml 1.5 mol/L 的蔗糖溶液， 然后小心地在 1.5 mol/L 的蔗糖溶液上加0.4ml 1.0 mol/L 的蔗 糖溶液，随后将(2)中获得的上清液0.5ml轻轻地加在蔗糖溶液 上，60000 g（21000 r/min左右，五楼实验室）离心 20 分钟。 线粒体会在 1 mol/L 和 1.5 mol/L 蔗糖界面处形成一薄层。 1. 在用于 Bockman SW28 号转头（或与其等同的产品）的 Uitradear 离心管中，小心地在 15 ml 1.5 mol/L 的蔗糖溶液上加一层 15 ml 1.0 mol/L 的蔗糖溶液，形成 30 ml 的梯度：1.0 mol/L 蔗糖和 1.5 mol/L 蔗糖溶液中含：10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)1 mmol/L EDTA，pH 小心加入线粒体悬液（总体积 7 ml），60000 g（22000 r/min）离心 20 分钟。线粒体会在 1 mol/L 和 1.5 mol/L 界面处形成一薄层。3. 移去样品层及其与 1.0 mol/L 层的交界。4. 用一巴斯德吸管轻柔的在 1.5 mol/L 层顶部吸出线粒体。5. 稀释蔗糖溶液，17000 g 离心 15 分钟沉淀线粒体。6. 用 30 ml 缓冲液洗一次，重悬浮于合适体积的适于后续工作的缓冲液中。

16 匀浆液 1500rpm 离心 1min (2次 去除大组织块）
去血蛙肝2克+10ml匀浆液 剪碎+组织匀浆 匀浆液 1500rpm 离心 1min (2次 去除大组织块） 每人1个1.5ml离心管（ 0.5ml匀浆缓冲液+ 0.5ml肝组织匀浆液） 注意：沉淀与上清液从离心机取出后均需置于冰上。 2700rpm离心10min 上清液 沉淀（细胞核及碎片） 重悬沉淀,2700rpm离心10min 制备0.4ml 1.0 mol/L + 0.4ml 1.5 mol/L的蔗糖梯度溶液， 上清液0.5ml轻轻地加在蔗糖溶液 60000 g（21000 r/min左右）离心 20min 12800rpm离心10min (可以冲洗一次) 吸取1小滴沉淀制一张涂片 吸取1小滴沉淀 涂片 吸取1小滴沉淀涂片

17 涂片过程：

18 五. 实验结果和作业： 1. 分离物观察、鉴定： ⑴ 细胞核：取细胞核沉淀一滴涂片，空气干燥，加入甲醇-冰乙酸固定15min，充分吹干，滴姬姆萨染液(原液10~20倍稀释)染色10min。自来水冲洗，吹干，镜检。 结果：细胞核紫红色，上面附着少量胞质及浅蓝色碎片。 (2) 线粒体：取线粒体沉淀涂片，注意勿太浓密，不待干即 滴加1/5000稀释的詹纳斯绿B染液染色20min，盖上盖玻片，镜检。 结果：线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。 2.作业 1）分别绘图描绘你所观察到的典型细胞核和线粒体的形态。2）比较差速离心与密度梯度离心方法分离出的线粒体的差异.