第四章、细菌遗传学I 质粒分配与不相容性 内容 学习要求 介绍当前对质粒分配和拷贝数控制的调控机制的研究，（参考教材101页）

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1 第四章、细菌遗传学I 质粒分配与不相容性 内容 学习要求 介绍当前对质粒分配和拷贝数控制的调控机制的研究，（参考教材101页）
认识质粒分配与不相容性

2 质粒 质粒是能独立于寄主染色体而自主复制并被稳定遗传的一类核酸分子 绝大多数的质粒是DNA型
知识点回顾 质粒 质粒是能独立于寄主染色体而自主复制并被稳定遗传的一类核酸分子 绝大多数的质粒是DNA型 目前已知只有酵母杀伤质粒(killer plasmid)是RNA型 绝大多数的天然DNA质粒为共价、闭合、环状的分子结构，即cccDNA (covalently close circular DNA ) 质粒DNA的分子量范围： kb

3 已学知识点回顾

4 一、质粒分配与不相容性

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6 混合配对模型

7 Random positioning of incompatible plasmids.
B. A large partition complex is more likely than a smaller one to activate and stabilize the positioning process. The plasmid with the larger centromere (circle) is thus more likely than that with the smaller one (ovoid) to be chosen for positioning and to be placed at the centres of the cell-halves; plasmids with smaller centromeres are more likely to wander and be lost. Note that repositioning will tend to moderate a preference for positioning plasmids with large centromeres/partition complexes. A. Sibling plasmids are initially paired, segregated and positioned along the cell. As fresh replicas are generated during the cell cycle, the positioning mechanism continues to be activated and to reposition plasmids two at a time, leading to asymmetric plasmid distribution and often to the absence of a plasmid from one cell-half.

8 ParB不直接相互作用的质粒间也可发生分配
Indirect pairing. Partition does not necessarily start by breaking the ParB–ParB interactions responsible for pairing partition complexes on sibling plasmids. Instead, ParA can be activated by a ParB–DNA entity that consists of either an isolated ParB–parS complex, a paired complex (as shown) or an ensemble in a plasmid cluster. Partition ensues when the activated ParA encounters another ParB–DNA entity, which may never have been in contact with the activating one. Thus, plasmids can be segregated as either clusters, pairs or individuals. 问题：细胞内的质粒是平均分配的么？

9 二、 质粒复制（拷贝数）与不相容性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,并赋宿主细胞特定的遗传性状.
根据在每个细胞中拷贝数的多寡，质粒可分为两大复制类型： ① 严紧型质粒(Stringent plasmid) ② 松弛型质粒(Relaxed plasmid) 一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并不是绝对的，同一质粒在不同的宿主细胞中可能具有不同的复制型，这说明质粒的复制不仅受自身的制约，同时还受到宿主的控制，同宿主的状况有关。

10 （一）、质粒复制的调控 为与宿主稳定地共存并把代谢负担减至最低, 质粒必须控制自身的复制。在一定的生长条件下、在一定的宿主菌中, 某一质粒的拷贝数(N) 通常是一定的。 负调控模型 质粒刚移入新宿主时,负调节因子的浓度可忽略不计, 质粒能在短时间内达到正常拷贝数, 然后通过增加或减少每细胞周期每质粒拷贝的复制率来调节细胞中的质粒拷贝数(N), 使该菌群中各细胞的质粒拷贝数维持在平均值(Nav )附近的一个很小的波动范围内。 上述控制机制是由质粒自编码的负控制系统通过调控复制起始率而实现的, 其负控制元件就编码在质粒上 依所用负控制元件的类型不同, 质粒复制的控制系统主要有: 重复子控制和反义RNA控制

11 1、重复子控制 复制起始蛋白Rep 蛋白能以二体形式结合于启动子区, 反式作用, 对其合成进行自我调节;
“手铐”模型( “handcuffing”model)

12 空间位阻模型 空间位阻模型认为, 决定质粒复制率的主要因素是重复子的浓度而不是Rep 蛋白的表达水平。当质粒拷贝数较低时, Rep蛋白与重复子结合并饱和, 促发复制起始; 随着质粒拷贝数的增加, 结合于某一起点重复子的Rep 分子, 开始与结合于另一起点重复子的Rep 分子相互作用, 并通过Rep- Rep 相互作用把2个环状质粒分子偶联起来, 形成“手铐”状的复合物, 导致这2个重复子区域之间出现空间位阻而阻断复制的起始。 在随后的细胞生长期间, 这种质粒对也逐渐分离, 使各质粒分子的复制起始潜力得以恢复。

13 ⒉ 反义RNA控制 在这一模式中,由质粒编码的抑制因子(反义RNA)结合在复制起始区的特定靶位点上,对复制起负调控作用。
反义RNA : 小RNA 分子, 长35～150 nt, 有1～4个茎-环( stem-loop) , 其序列与靶转录物 5' 端的一个区域互补, 又称反转录RNA( countertranscribed RNA, ctRNA) 反义RNA的作用方式主要有以下两种: ⑴ 抑制引物RNA 加工 (以ColE1质粒为例来说明) ⑵ 抑制前导肽翻译 (以R1质粒为例来说明)

14 ⑴抑制引物RNA 加工 ColE1 质粒的复制起始由一长为700 nt 的转录物RNAⅡ(preprimer)引发。RNAⅡ由宿主RNA 聚合酶合成, 经构象变化后, 与模板DNA在复制起始区附近偶联(coupling)形成RNAⅡ-DNA杂交物, RNase H切割其中的RNA 部分, 产生游离的3‘ - OH, 再在DNA 聚合酶Ⅰ的作用下, 从这个游离的3’ - OH开始DNA前导链的合成。 3‘ - OH的生成是复制起始的限速步骤, 受反义RNA(RNAⅠ)调控。RNAⅠ序列与RNAⅡ的前108 碱基序列完全互补, 互补区结合可改变RNAⅡ下游效应位点的二级结构, 使RNAⅡ的3’ 端不能与模板DNA偶联,RNase H 就不能对RNAⅡ进行加工, 从而阻断引物的生成, 抑制复制的起始。

15 RNAⅠ的启动子是组成型的, 故其数量与质粒拷贝数成正比, 但不稳定。
除RNA1以外还有Rop 蛋白强化这种抑制 控制复制引物与模板的结合 RNAⅠ的启动子是组成型的, 故其数量与质粒拷贝数成正比, 但不稳定。 在ColE1 中还有一个质粒编码的控制元件Rom 蛋白(又称Rop 蛋白) , Rop蛋白是RNA 结合蛋白, 它能增强RNAⅠ与RNAⅡ的相互作用, 稳定RNAⅠ- RNAⅡ复合物, 因而能加强对复制的抑制作用, 但在上述控制回路中只起辅助作用。

16 ⑵ 抑制前导肽翻译 这种作用方式的例子是质粒R1（两种方式）, 它的基本复制子含有可读框copB、tap 和repA, 分别编码转录阻遏蛋白CopB、前导肽TAP和起始必需蛋白RepA。tap 和repA 是翻译偶联的。RepA蛋白是复制的限速因子, 以顺式作用, 但不能重复使用, 其复制控制在转录和翻译两个水平上进行。主控制元件是RNAⅠ,从repA-mRNA 前导区的一段互补链转录而来, 长约90 nt。 质粒拷贝数(基因剂量)与RNAⅠ水平呈正相关

17 CopB可以二聚体形式阻遏repA始自PrepA启动子(位于copB下游)的转录。在稳态条件下，CopB呈饱和浓度，可充分阻遏repA始自PrepA的转录，使其维持在基线水平。此时，repA mRNA 主要以copB-tap-repA RNA 多顺反子形式合成。但在质粒定居的早期阶段，质粒拷贝数很低，CopB介导的阻遏失效。此时， PrepA启动子去阻遏，repA 转录为tap-repA mRNA，

18 2、 质粒不相容性 质粒不相容性的原因 质粒的不相容性现象主要是与质粒的复制调控和分离(segregation)机制有关，不能在同一细胞中并存的质粒是因为他们共享一个或多个共同的复制因子或相同的分配系统。(对于单拷贝质粒???) 当两种复制及调控机制毫不相干的质粒在同一个细胞中生存时,它们各自复制,再各自分配到不同的子细胞中,不会发生干扰。当两种复制及调控机制相关或相同的质粒在同一个细胞中生存时,质粒复制及调控机制就会把它们看做成同种质粒而将他们的拷贝数控制在一定的数目内。由于细胞时质粒在子细胞中分配不均匀的缘故,经过几十次的细胞分裂后,就会造成敏感质粒的分离丢失。

19 本节总结 不相容性的分子生物学基础是质粒的复制调控机制存在同源性,此外具有相同复制起始位点和分配区的两种质粒也不能共存于同一个宿主菌
影响不相容性的主要因素: ⑴质粒分离机制(segregation system) ⑵ 重复子 ⑶ 复制起始位点 ⑷反义RNA编码区