第三节 聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）

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1 第三节 聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）
PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。 体外程序化的DNA合成技术。

2 PCR

3 原 理： 1）合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；
原 理： 1）合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度； 2）反应体系：DNA模板，dNTP，Taq DNA聚合酶，buffer 3）反应程序： 变性94~95oC 复性 延伸 37~55 oC ~72 oC 72 oC延伸10min DNA扩增100万倍

4 PCR扩增

5 PCR特点及应用： 特点：（1）特异性强，灵敏度高，稳定可靠，快 速； 2）微量的模板DNA即可扩增大量产物;
（2）遗传物质的鉴定； （3）遗传病的诊断; 缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。

6 PCR相关技术： 1.增效PCR（booster PCR）
当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15～20个循环后补充产物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。

7 2. 巢式PCR（nest PCR） 　　　此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。 　　　除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。

8 3、多重PCR 在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。 多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。

9 4.RT-PCR RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ng～ug水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。

10 RT-PCR

11 RT-PCR cDNA

12 五、单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP）
　是指单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代，微小的缺失或插入的检测。 通常与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。 在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物，进行PCR扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出判断。

13 PCR-SSCP过程： 原 理 过 程 解链 构像 DAN ---------------------------
原 理 过 程 primer ↓ P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 ↓ 变性 单链DNA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳   ↓ 自显影 ↓ 为正常 结果分析 、4、5纯合患者 3.为杂合子 . DAN 解链 构像

14 第二节 DNA多态 DNA多态（DNA Polymorphism）：
群体中每个个体（体细胞）的两套单倍体DNA是不完全相同的，一般每100～500bp就有一个是不相同的，它们多位于内含子序列中，表型并没有改变，这种表现称为DNA多态。常用做遗传分析中的标记。 除一卵双生子外，没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。

15 DNA分析中常用的多态性标记有3类： 1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；
2）重复序列多态性：短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记； 3）单碱基多态性（SNP）：DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。

16 一、序列多态（或点多态） 　　限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP ）。 　　由于碱基的变异可能倒致限制酶切点的消失或新的酶切点出现，从而引起不同个体的DNA在用同一限制酶切割时，产生DNA片段长度的差异。这种由于酶切位点变化导致的DNA片段长度的差异称为RFLP。 　　RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。

17 Allele II 产生了新的酶切点 Allele I 12Kb 8Kb Allele II probe 12Kb 8Kb 4Kb
RFLP—Southern blot检测结果

18 AlleleII酶切位点消失

19 二、序列长度多态性（或数目变异串联重复，variable number tendom repeats, VNTR）
重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列。散在地分布于染色体上，以插入/缺失方式形成多态。如图： VNTR两侧的酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。

20 VNTR 酶切，电泳后的检测结果 大 小

21 PCR-VNTR检测

22 　　通常，重复单位16～28bp长，称为小卫星DNA。 重复单位２～6bp长，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA。 　　DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）  

23 PCR-VNTR

24 生物芯片技术 九十年代以来，发展了一种新的分子生物学技术，引起了人们的极大关注。生物芯片，实际上是一种微型多参数生物传感器。它通过在一微小的固体载体表面固定大量的分子识别探针，构建一组微分析单元和系统，以实现对化合物，蛋白质，核酸，细胞或其他生物组分准确，快速，大量的筛选或检测。 基因芯片（又称DNA芯片，生物芯片，DNA探针微列阵），它集成了大量的密集排列的基因探针，通过与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸序列的分子识别。能在同一时间内分析大量的基因，实现生物基因信息的大规模检测。

25 基因芯片 如： 靶基因 基因组 特异性片段 探 针 ----AGCTTAGC---- 靶序列 ----TCGAATCG---- probe
如： 　靶基因 　　基因组 特异性片段 探 针 ----AGCTTAGC---- 靶序列 ----TCGAATCG---- probe A B C 检测

26 基因芯片的应用： 　一、基因组扫描 　二、寻找基因功能 　三、基因型及单碱基多态（SNP） 　四、突变检测 　五、基因表达