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Yeast two-hybrid system
酵母双杂交体系 Yeast two-hybrid system
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酵母双杂交 (yeast two hybrid) 技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用的技术.
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背景知识 真核生物转录起始前区域结构: -25bp区有：TATA 序列 称为Hogness盒或TATA box，为启动子核心序列。
上游更远处 增强子 统称顺式作用元件
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转录因子 能直接或间接辨认和结合上游区段DNA的蛋白质----反式作用因子. 其中能直接或间接与RNA聚合酶结合的称为转录因子(TF).
真核生物的TFⅡ又分为TFⅡ A与TFⅡ B
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真核生物转录起始前复合物 TFⅡD识别TATA TFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合体
TFⅡB为桥梁并提供结合表面,促使TFⅡF-RNA pol复合结构进入启动子核心区TATA. TFⅡE的ATPase分解ATP,解开DNA双螺旋. TFⅡH进入完成转录起始前复合物(PIC) 启动合成RNA第一个碱基.
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真核转录因子的结构域 两个结构域 DNA结合结构域(DNA-binding domain，BD)
一个或多个与其他调控蛋白相互作用的转录激活结构域(activation domain，AD)
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酵母转录因子GAL4结构特点 GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域. 两结构域：DNA结合域 转录激活域
特点：结构上可分开、功能上相互独立
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基本原理 DNA结合域（DNA-BD）：N端1-147氨基酸 转录激活域（AD）：C端 氨基酸
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DNA-BD：识别GAL4效应基因上游的激活序列（UAS） ，并与之结合
AD：通过同转录机制(transcription machinery)的其它成分之间的结合以启动上游激活序列（UAS）下游的基因转录。
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用DNA重组技术，将DNA-BD和AD分开，并放在同一宿主细胞中表达。
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将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。
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将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。
产生的GAL4 DNA-BD和AD多肽 不直接发生相互作用，不能激活相关的效应基因进行转录
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同时用上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中不能产生GAL4。
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Lac Z(报告基因) GAL4的DNA-BD和蛋白质X结合形成杂种蛋白，与GAL1的UAS序列结合，但由于无AD的参与，报告基因不转录。
（上游激活序列） Lac Z(报告基因) 启动子
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GAL4的AD同蛋白质Y结合，形成的杂种蛋白，未与UAS序列结合，不能启动报导基因转录。
GAL1 UAS （上游激活序列） 启动子 Lac Z(报告基因)
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通过此两个杂种蛋白中的X与Y的相互作用，在细胞内重建了GAL4的功能，启动报导基因表达。
GAL1 UAS （上游激活序列） 启动子 Lac Z(报告基因)
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缺陷型宿主菌株 常见的有SF562和HF7c. 特点： 无表达GAL4转录激活因子的能力
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载体------穿梭质粒 pGBT9, 又称DNA-BD质粒载体。靶基因插入可与GAL4-BD形成融合蛋白Ⅰ。
pGAD424，又称AD质粒载体。靶基因插入可与GAL4-AD形成融合蛋白Ⅱ。 二者均可在大肠杆菌和酿酒酵母中自主复制。 两种融合蛋白可在酵母中高表达。在核定位序列作用下，进入酵母细胞核内。
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（ADH1:醇脱氢酶1）
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实验程序 1 分别重组两种穿梭质粒载体。 2 分别导入E.coli培养。 3 分别提取两种质粒。 4 转化酵母菌 5 筛选阳性克隆
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应用---蛋白质相互作用 筛选单抗 蛋白质-蛋白质相互作用 筛选酶抑制剂 …
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