端粒与端粒酶 陈莉 南通大学基础医学院.

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1 端粒与端粒酶 陈莉 南通大学基础医学院

2 早在30年代，两名遗传学家Muller和Mcclintock分别在不同的实验室用不同的生物做实验发现染色体末端结构对保持染色体的稳定十分重要，Muller将这一结构命名为端粒（telomere）。直到1985年Greider等从四膜虫中真正证实了端粒的结构为极简单的6个核苷酸TTAGGG序列的多次重复后发现了端粒酶(telomerase TRAP-eze) 。

3 端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。 端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸－蛋白复合体,其功能在于维持染色体的稳定性和完整性。 端粒酶是一种核酸核蛋白酶,能以自身的RNA为模板合成端粒的重复序列,以维持端粒长度的稳定性。 许多研究表明,端粒、端粒酶的功能失调将影响细胞的生物学行为，包括细胞周期的稳定性、细胞增殖、癌变、凋亡、衰老。

4 第一节 端粒与端粒酶 一、端粒的结构与功能　 1972年James Watson提出了“复制末端问题”，复制DNA的DNA多聚酶并不能将线性染色体末端的DNA完全复制。也就是说在线性DNA复制时，DNA多聚酶留下染色体末端一段DNA（一段端粒）不复制。 端粒DNA复制的特点是在每次DNA 复制中，每条染色体的3'端均有一段DNA无法得到复制，随着细胞每次分裂，染色体3'一末端将持续丧失50-200bp的DNA，因而细胞分裂具有一定的限度，即分裂寿命。所以端粒的长度可作为细胞的“分裂时钟”，反映细胞分裂能力。

5 真核细胞染色体末端会随着细胞分裂而缩短，这个缩短的端粒再传给子细胞后，随细胞的再次分裂进一步缩短。随着每次细胞分裂，染色体末端逐渐缩短，直至细胞衰老。人类体细胞遵循这个规则从细胞出生到衰老，单细胞生物遵循这个规则分裂后定有其它机制保持单细胞生物传代存活，生殖细胞亦如此。

6 端粒：是真核细胞线性染色体末端特殊结构。
由端粒DNA和端粒相关蛋白组成。 端粒DNA：为不含功能基因的简单、高度重复序列, 在生物进化过程中具有高度保守性。 不同物种的端粒DNA 序列存在差异。 人类及其它脊椎动物染色体端粒的结构是5′TTAGGG3′的重复序列, 长约15kb。体细胞的端粒有限长度（telomere restriction fragments TRFS）大多数明显短于生殖细胞，青年人的TRFs又显著长于年长者，提示TRFs随着细胞分裂或衰老，在不断变短，主要是由于DNA聚合酶不能完成复制成线性DNA末端所致。

7 端粒DNA由两条互相配对的DNA 单链组成, 其双链部分通过与端粒结合蛋白质TRF1和TRF2 结合共同组成t环(t loops)。这种t 环特殊结构可维持染色体末端的稳定,保持染色体及其内部基因的完整性,从而使遗传物质得以完整复制。缺少端粒的染色体不能稳定存在。 端粒DNA与结构蛋白形成的复合物如同染色体的一顶“帽子”，它既可保护染色体不被降解，又避免了端粒对端融合（end-end fusion）以及染色体的丧失，同时端粒能帮助细胞识别完整染色体和受损染色体。在生理情况下，端粒作为细胞“分裂时钟”能缩短，最终导致细胞脱离细胞周期。

8 二、端粒酶的结构与功能 在端粒被发现以前，人们就推测生殖细胞之所以能世代相传，其中可能存在一种维持端粒长度的特殊机制，体细胞可能正是由于缺乏这种机制，它的染色体末端才面临着致死性缺失（deletion）的危险。因此在正常人体细胞间永生化细胞（immortalized cells）及肿瘤细胞的转化过程中可能也存在着与生殖细胞类似的机制。这些细胞怎样保持细胞具有继续分裂或长期分裂的能力呢？科学家们发现端粒确实随着每次分裂而缩短，但也会被新合成的端粒片断再延长。科学家们怀疑，可能尚有末被发现的酶，该酶具有标准的DNA多聚酶所不具备的功能，能使已缩短的端粒延长，使科学家们兴奋的是到1984年首先在四膜虫中证实了这种能使端粒延长的酶—端粒酶的存在。

9 端粒酶逆转录酶（TERT） 端粒酶结合蛋白（TEP） ㈠ 端粒酶的结构
端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体,由RNA 和结合的蛋白质组成,是RNA依赖的DNA 聚合酶。它是一种特殊的能合成端粒DNA的酶,通过明显的模板依赖方式每次添加一个核苷酸。 端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶 端粒酶RNA(hTR) 端粒酶逆转录酶（TERT） 端粒酶结合蛋白（TEP）

10 人类TERT（hTERT）基因为一单拷贝基因,定位于5p15
人类TERT（hTERT）基因为一单拷贝基因,定位于5p ,具有7个保守序列结构域单元和端粒酶特异性结构域单元T。破坏TERT 将消除端粒酶活性并致端粒缩短。 端粒酶逆转录酶（TERT） 端粒酶RNA(hTR) 端粒酶RNA是第一个被克隆的端粒酶组分。端粒酶RNA含有与同源端粒DNA序列TTAGGG的互补序列,核糖核酸酶H切割此模板区,能使体外消除端粒酶延长端粒的功能。 端粒酶结合蛋白（TEP） TEP1、生存动力神经细胞基因(SMN) 产物、 hsp90 、 PinX1、 Est1p 和Est3p

11 1、端粒酶RNA(hTERT) 哺乳动物端粒酶RNAs(hTR和mTR)在许多组织的不同发育阶段,甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛表达。 体内端粒酶RNA 的存在对端粒酶功能至关重要，影响到端粒酶RNA 的稳定性与突变,也可改变体内端粒长度，并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡 。 端粒酶RNA转录模板 远端区参与和底物的结合。 近端区能添加特定的核苷酸,对底物识别并不重要。模板边界区与端粒酶催化亚基TERT结合,也与端粒酶相关因子Est1p和Ku 结合。

12 2、端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT)　
几乎所有存在端粒酶的机体均含有一单独的TERT 基因, 哺乳动物TERT 的转录由许多转录因子、激素和细胞外信号严格控制。不同的转录因子调节hTERT在不同的细胞内含物中的表达。癌基因c-myc是一个受特殊信号调节的可诱导癌基因, 并可与H－Ras、N－Ras、多瘤病毒MT、LT 等癌基因协同作用, 促进细胞无限增殖, 获得永生化并发生癌变。

13 c-myc 与hTERT Fujimoto等用c-myc 反义寡核甘酸转染白血病细胞后, 这些细胞中端粒酶活性均能被下调, 而c-myc 正义寡核甘酸无此作用。 Wang等研究发现c-myc在正常人乳腺上皮细胞和二倍体成纤维细胞中诱导端粒酶活性, 并能延长这些细胞的寿命。因此认为癌基因c-myc为一重要的端粒酶激活剂。 存在于hTERT核心启动子中有两个重要的c-myc 结合位点(CACGTG,亦被称为E 盒)。c-myc 诱导的hTERT 表达起始速度快,不受细胞增殖或额外的蛋白合成的影响,与c-myc 引起的直接的转录激活一致。但癌基因c-myc 不是唯一与hTERT基因调节有关的转录因子。

14 近期研究表明,Sp1 协同c-myc 激活hTERT的转录,可能还有其他因子,如Bcl-2 抗凋亡基因、E6HPV16 型蛋白，以及经过一些蛋白激酶的磷酸化使hTERT 上调。但在诸多不同类型的瘤细胞中,致hTERT上调的基本激活剂是c-myc。 TERT内的N-残基对多种功能是重要的, 包括与端粒酶RNA结合、端粒酶RNA 装配和催化作用、与p53 的相互作用和细胞永生化。 TERT的C-残基也在人类原始纤维母细胞的永生化、端粒组装的竞争、核仁内定位、引物结合和渐进性延长等方面起重要作用。

15 3、端粒酶相关蛋白(TEP) ⑴ 端粒酶相关蛋白-1(TEP1)是一多功能的RNA 结合蛋白，TEP1 缺失导致rRNA 水平的显著降低以及TEP1 和rRNA 的丢失,但不导致端粒酶活性或端粒长度的紊乱。 ⑵ 生存动力神经细胞基因(SMN) 产物 热休克蛋白（hsp）90 、其他涉及到TERT转录后修饰的蛋白包括磷酸酶-A、Akt 、cAbl 、p53 和PARP。 PinX1 与人TERT体外共表达时抑制人端粒酶活性。 ⑶ 芽殖酵母蛋白Est1p 和Est3p 这两个蛋白与体内端粒酶的功能有关。Est1p 足以使端粒延长。但是,在无Est1p存在的情况下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以维持端粒长度。

16 ㈡ 端粒酶的功能 端粒酶是在染色体末端不断合成端粒序列的酶，它可以维持端粒的长度，维持细胞增殖潜能。端粒酶以自身RNA为模板合成端粒酶重复序列，具有逆转录酶活性，它的活性不依赖于DNA聚合酶，对RNA酶、蛋白酶和高温均敏感。端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，抑制细胞的衰老，在生殖细胞和干细胞中可检测到高水平的端粒酶活性。 在体内还不清楚每一次细胞分裂有多少端粒DNA合成。体内端粒酶的延长功能是一复杂的动态过程:受双链端粒结合蛋白包括RAP1 (芽殖酵母) 、存在于t环的TRF1 (依赖于端粒酶)和TRF2(不依赖于端粒酶)的负调控。

17 端粒－端粒酶对细胞死亡和细胞永生化的影响
第二节 端粒－端粒酶对细胞死亡和细胞永生化的影响 “端粒－端粒酶假说”认为端粒酶的激活与细胞永生化和恶性肿瘤的发生、发展密切相关。染色体末端的端粒DNA进行性的缩短是限制人细胞寿命的先决条件。相对地,端粒酶的激活,合成端粒的DNA被认为是细胞永生化和癌症发展必需的一步。目前的资料证实,端粒酶对长期成活的组织和长期进行有丝分裂的细胞是必需的。

18 细胞的死亡过程分为两个阶段, 当端粒缩短至一关键性长度2kb-4kb 时,染色体的稳定性就会遭到破坏,细胞开始衰老进入M1期（mortality stage1 M1）。在M1期细胞对生长因子等失去反应，产生DNA合成蛋白抑制因子，细胞周期检查点（cell cycle checkpoints）发送周期停止信号，DNA合成停止，DNA 断裂,活化p53 依赖或非p53 依赖的DNA 损伤途径。并诱导细胞周期依赖性激酶（CDK）抑制物如p21 ,p27产生,导致细胞G1期生长停滞,最终走向死亡。如果这一过程中一些癌基因SV40T抗原、PRB ,p53 ,p16 等抑癌基因失活,丧失正常功能, 均能使M1期的机制被抑制使细胞逃逸M1期，继续生长获得额外的增殖能力，此时端粒酶仍为阴性，端粒继续缩短，经过20-30次分裂后，最终到达M2期。细胞由于端粒过短,基因不稳定,绝大多数细胞死亡,只有极少数细胞由于端粒酶活性的上调或重新激活,端粒的功能得到恢复,基因重获稳定,使细胞超越M2期,成为永生化细胞。

19 端粒酶在人体细胞永生性转化中 正常人体细胞 端粒丢失 M1期阻滞 SV40T抗原 细胞分裂停止 Rb、P53与病毒蛋白结合、突变 ↓
端粒酶被抑制 正常人体细胞 端粒丢失 M1期阻滞 SV40T抗原 细胞分裂停止 Rb、P53与病毒蛋白结合、突变 ↓ M1—M2期间隔 永生化 双着丝粒形成 M2期退化 染色体失稳 端粒酶被激活 细胞凋亡

20 第三节 端粒酶细胞周期中细胞增殖、凋亡的影响 一、端粒酶对细胞周期的影响
端粒酶活性与细胞周期密切相关。细胞周期所处阶段不同,端粒酶活性亦不同, 端粒酶活性与细胞周期CDK-CKIs 网络调控系统有关 。实验发现永生化细胞株在细胞周期各个时相都有端粒酶活性,而静息细胞中活性降低,随着肿瘤细胞进入G1/S 期,端粒酶活性逐渐升高,在复制S 期端粒酶活性最高,而在G2/M期端粒酶活性逐渐丧失,当培养细胞处于无血清而进入G0 期时,端粒酶活性不受影响。在人乳腺癌中,端粒酶的高活性水平伴有cylinD 或cyclin E 的高表达,某些周期蛋白可能参与端粒酶活性的调控。

21 各种基因毒性或环境应激所致细胞DNA双链破坏时可使野生型p53活化, 进而引起细胞周期停滞或诱导细胞凋亡, 使细胞得以避免表型恶性转化。端粒双链DNA 的破坏是否也能活化p53依赖的信号传导通路呢?kusumoto等在构建的端粒酶和p53单或双缺陷鼠体内研究证实, 端粒DNA的丢失可以诱导活化p53和p21WAF1, 并导致细胞周期停滞，而p53的缺失则可促进端粒序列的丢失, 增大染色体的融合频率。端粒功能的缺失以及相继出现的基因不稳定与p 53缺陷相协同而激活细胞恶性转化过程。

22 二、端粒酶对细胞增殖的影响 曾一度认为端粒酶活性是细胞恶变或永生的标志,然而,不但在正常组织的永生化细胞(如造血干细胞、精子) ,而且在非永生的、正常生理状态下增殖活跃的细胞(如受抗原刺激的T及B淋巴细胞、口腔和食道粘膜上皮、皮肤基底层角质形成细胞、宫颈上皮、小肠上皮) 也可检出端粒酶活性。但Lehner 等用定量RT-PCR 法在子宫内膜癌、增生期子宫内膜、分泌期子宫内膜及萎缩性子宫内膜检测到hTERT mRNA 表达值差异显著。可见,不同增殖程度的子宫内膜均表达端粒酶活性,但其程度不同。因此,借助端粒酶定性检测判断良恶性增殖,其意义明显不如定量检测。

23 已有多次报道:改变实验条件可使多种端粒酶活性阴性细胞表达端粒酶活性,并获得永生;反之,抑制某些增殖活跃组织的端粒酶活性能抑制细胞增殖。
另有人发现:端粒酶通过调节端粒长度和生长促进因子基因表达来影响细胞增殖 。提示端粒酶是细胞生长、增殖中的重要机制。

24 但少数永生化的肿瘤细胞株和一些软组织肿瘤虽然没有端粒酶活性,但仍有较长端粒,提示还存在不依赖端粒酶的端粒延长机制 。
此外用识别hTR 3′端不同序列的三种核酶作用于肿瘤细胞,4周内端粒酶活性降低,端粒缩短,增殖速度没有改变。 其他研究如黑素瘤细胞,8周内端粒酶活性降低,但是传代超过20 代后,端粒长度不缩短,细胞持续增殖。说明除了端粒、端粒酶引起细胞增殖的作用外，还有其他引起细胞的增殖机制。

25 三、 端粒酶对细胞凋亡的影响 启动凋亡的某些基因位于端粒结构附近, 完整的端粒结构可以抑制这些基因的表达, 而维持端粒长度主要依赖于端粒酶。
Holt等在实验中发现, 通过异位表达端粒酶,而使端粒长度保持稳定的某些正常细胞对凋亡的抵抗力增强； 用实验方法使端粒酶阳性细胞端粒延长, 子代细胞生存和抗凋亡能力将增强；端粒酶阳性永生化细胞要比端粒酶阴性永生化细胞有更强的抗凋亡生存能力。这些与两个主要的凋亡途径—核内钙依赖核酸内切酶诱导途径和Caspese家族中IL-1B转换酶活化途径存在缺陷有关。此外, 研究发现诱导hTERT 显性突变,降低肿瘤细胞内源性端粒酶活性, 肿瘤细胞端粒将持续缩短, 继之异常有丝分裂增多, 并最终出现大量凋亡细胞。

26 第四节 端粒酶与衰老 如何使人体衰老延迟，一直都是人类所不断追求的。虽然科学家们发现了一些抗衰老的药物和方法，但都不够理想。细胞经过一定次数分裂后，端粒的不断丢失使细胞就进入不可逆转的生长抑制状态，脱离了细胞周期而衰老、凋亡，此过程即为复制性衰老。在体外培养中，衰老细胞逐渐增多的过程中，可用端粒序列的逐渐丢失来作衰老量化机制精确模型。随着年龄增长，染色体中端粒长度缩短。

27 在早老患者中有一个过早的端粒缩短，进而缩短的端粒允许染色体融合，这些现象与年老患者的细胞中或培养的老化细胞中染色体组型衰老异常的高发生率密切相关。既然端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，使端粒在细胞复制过程中不会丢失，细胞衰老的进程也能被阻止，从而寿命延长——这正是人们研究的端粒酶与抗衰老关系的新热点。

28 端粒酶延长端粒长度以减慢细胞衰老最早的证据来自Bodnar等的研究，1998年其在Science上刊文报道：将人的端粒酶基因导入端粒酶阴性的正常人体细胞中激活其表达并培养细胞，然后与未导入该基因的细胞比较，发现前者端粒明显增长，细胞分裂旺盛，细胞寿命比后者大大延长，更令人关注的是细胞并无肿瘤样改变。Kudo等报道端粒酶活性和细胞凋亡可作为伴有或不伴有子宫内发育延迟的胎盘衰老的标志。

29 Mattson等亦认为在研究神经细胞分化和存活中激活端粒酶与TERT功能，能较好地避免神经细胞死亡，还可以促进神经细胞在各种神经元退化性病变条件下的恢复。
阿尔茨海默病（Alzheimer`s disease，AD）是一种常见于老年人的神经系统退化性疾病，其患者的脑血管壁中可分离出致AD神经元退行性病变的ß-淀粉样蛋白。 Zhu等利用反义技术和端粒酶抑制剂引发胎鼠海马区神经细胞中TERT的功能抑制，发现显著增加了由ß-淀粉样蛋白肽引起的细胞凋亡； 嗜铬细胞瘤细胞中TERT的过量表达会降低此种细胞凋亡。  

30 其原因是TERT功能降低的神经细胞在暴露于ß-淀粉蛋白中能增强其氧化性并使线粒体功能发生障碍，因而引起细胞凋亡。TERT在神经退行性病变实验模型中展现出有神经保护性功能，提示在神经细胞中若能提高端粒酶的活性可能会抑制与衰老相关的神经退行性病变，如AD和脑老化的发生等。

31 端粒缩短加快可在许多病变中观察到:如Down 综合征、Werner 综合征、毛细管扩张失调症 、先天性角化不良等,虽然有些遗传异常和端粒缺陷的关系还不清楚,但可能的原因有:
①端粒核酸外切酶活性和(或)有效利用的增加。 ②端粒过度丢失。 ③在发育或出生后端粒补偿机制的不足(端粒酶或正性ALT样功能)。 端粒缩短加速可由于环境的应急介导的DNA 损害或对这些损害敏感度增加所致。不管何种原因,端粒缩短速率增加可致增殖组织的早衰特征,但也促进由于致瘤突变而获得增殖活性提高的克隆过分生长。

32 第五节 端粒酶活化是肿瘤的显著特征 尽管有研究认为端粒长度维持还可以借助于非端粒酶依赖模式，即端粒替代延长（altematire Lengthening of telomere ALT）机制，但其存在上并不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。自从1994年Kim等创立TRAP法检测端粒酶活性以来，越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数人类原发性肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到。美国学者在400多例来源于12 种不同组织的原发肿瘤病例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达84.8％，而肿瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为4.4％。

33 附表 人体组织中端粒酶活性 肿瘤部位/类型 与肿瘤邻近正常组织/良性病变 肿瘤组织（%） 肺 3/68（4.4%）
附表 人体组织中端粒酶活性 肿瘤部位/类型 与肿瘤邻近正常组织/良性病变 肿瘤组织（%） 肺 3/68（4.4%） 109/136（80.1%） 乳腺 2/28（7.1%） 19/24（79.6%） 前列腺 1/18（5.6%） 23/27（85.1%） 结肠 0/45（0） 22/23（95.6%） 肝 —— 1/1（100%） 卵巢 0/8（0） 7/7（100%） 肾 0/55（0） 40/55（72.7%） 神经母细胞瘤 0/17（0） 94/100（94%） 血液（淋巴瘤，CLL ALL） 21/23（91.3%） 脑 6/8（75%） 其它（头顶部，Wilms瘤） 8/93（8.6%） 24/26 (92.3) 合计 14/332 （4.2%） 365/430 (84.8)

34 Shay等报道了几年不同学者对肿瘤端粒酶探讨的检测结果，总结了正常组织（196例），原位癌（410例），恶性肿瘤（2031例）和癌旁组织（690例）的端粒酶的阳性率，它们分别是0.5%、30%、85%和11%。在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶的阳性率为85.0%～95.0%，而对应的癌旁或良性病变组织中，端粒酶基本上不能检出或活性极微弱。Sumida等的研究结果表明,端粒酶在各种肿瘤中的阳性率分别为:口腔鳞状细胞癌80 %～90%,食道癌87%,胃癌85%,肺癌80.1%,肝癌85%,乳腺癌85%,肾癌71%,胰腺癌95%,端粒酶阳性率与肿瘤发生之间表现出良好的相关性。

35 Orlando 等对泌尿系统恶性肿瘤进行了深入的流行病学调查,结果发现肾癌组织中端粒酶阳性率为69%(345/497),正常肾组织为2%(7/344);膀胱癌组织中端粒酶阳性率为90%(342/381),正常组织为27% (36/134);膀胱癌患者尿液中端粒酶阳性率为65%(436/675) ,膀胱灌洗液中端粒酶阳性率为72 %(131/182) ,而正常人为9%(47/ 486);前列腺癌组织中端粒酶阳性率为80%(266/332),邻近组织为38%(32/83) ,前列腺上皮瘤为16%(4/25) ,良性前列腺肥大为8%(11/129) 。

36 85%～90%的人肿瘤细胞中可以检测到端粒酶活性,而正常细胞中却没有或活性很低。人们推测肿瘤细胞逃避衰老持续增殖是端粒酶激活或端粒维持机制改变的结果。
一般认为,端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程中的一个后期事件,使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩短而得以维持,避免了细胞正常的复制-衰亡机制的制约而获得永生性,这是恶性肿瘤细胞显著的生物学特征之一,是癌变机制中一个十分重要的环节。

37 对细胞端粒功能的观察和推测的最显著的特征是发生端粒长度的维持,甚至在离开常规的激活时端粒长度维持机制(TMM)的延长,使初期细胞突破衰老屏障后癌变。发生的原因,最可能为过度的端粒酶激活或ALT样功能在在细胞癌变中端粒长度的保留或增加,允许在致瘤突变发生时异常克隆的扩展。 一些端粒酶阴性的癌症通过一种或几种ALT途经维持端粒的长度。端粒酶或ALT机制存在于绝大多数肿瘤细胞中以通过添加端粒重复序列而维持端粒的长度。 在一些肿瘤中也观察到一些端粒缩短的现象，可能的机制是由于细胞分裂的增加端粒缩短，导致异常修复事件使染色体发生端端融合。端端融合的后果是在随后的细胞分裂过程中发生染色体断裂,进而导致遗传不稳定和肿瘤易感性。

38 美国学者在CML和AML的端粒动力学研究中，用southern印迹法测量端粒长度，用stretch-PCR法测出端粒酶活性，在CML白细胞中，端粒酶活性非常低与正常组织相似。但若CML急性发作时，白细胞中端粒酶活性就表现为显著升高。表明CML由慢性到急性发作时，高度激活了端粒酶。通过对CML和AML病情进展研究，发现所有病例中肿瘤细胞的端粒与相应正常细胞相比都是缩短的，这可能是由于肿瘤细胞分裂次数远远大于正常细胞之故。

39 端粒危机 有些实体肿瘤细胞中端粒酶激活，但端粒并末缩短而是延长出现了矛盾的现象，被称之为端粒危机（端粒缩短和端粒酶激活）。这是肿瘤细胞克隆繁衍的强大驱动力，促进肿瘤的发展。 端粒危机的 假说的可能解释为：许多血液学的恶性肿瘤都不会在局部形成肿瘤，细胞的增殖和循环都是单细胞的，因此每一个白血病细胞都将竞争更有效的增殖，使突变细胞在短期内形成群落。与此相反实体肿瘤位于一点而不移动，因此子代对于不同突变的竞争被其紧邻所限制。实体肿瘤中大多数成功的克隆将比白血病细胞有更稳定的遗传特性。因为位于特殊环境中的特殊表型必须保持相当长的时间才能克隆形成群落，所以实体肿瘤只有具备较长的端粒，才能有较稳定的遗传特性，具备“最好”的表型从而被选择，进而生长繁殖。

40 端粒酶水平与某些肿瘤恶性程度相关。采用端粒重复放大测定法(telomeric repeat amplification protocol ,TRAP) 检测膀胱癌患者尿液中端粒酶的活性,Ⅰ期肿瘤患者端粒酶阳性率为79 %(包括15 例细胞学检测阴性患者) , Ⅱ期和Ⅲ期肿瘤患者端粒酶阳性率分别为84%及87.5 %; 66%的膀胱炎患者端粒酶阴性,其中7 例有假阳性;而健康者均为阴性。 对区分良性与恶性甲状腺瘤, hTERT 是敏感的标志物 ,从24 例患者的甲状腺结节穿刺物中提取RNA ,进行RT-PCR 扩增hTERT 基因,与细胞学和组织学检查结果比较,hTERT 阳性与恶性甲状腺瘤的符合率为93 % ,hTERT 阴性与良性甲状腺瘤的符合率为90 %。因此,随着研究的不断深入,端粒酶和hTERT有望成为肿瘤诊断及恶性程度分类的标志物 。

41 第六节 以端粒酶为靶标的抗癌药物研究 在85%以上的肿瘤细胞和组织中高度表达端粒酶，因此端粒酶是一个较理想的抗肿瘤药物靶标。
  在85%以上的肿瘤细胞和组织中高度表达端粒酶，因此端粒酶是一个较理想的抗肿瘤药物靶标。 (1)使用端粒酶抑制剂后,肿瘤细胞端粒缩短直至足以对增殖产生负面效应,这种时间上的滞后与起始端粒的长度有关； (2)至少在理论上肿瘤细胞存在抗端粒酶抑制剂或不依赖端粒酶的端粒维持机制的可能； (3)端粒酶抑制剂对人表达端粒酶的体细胞可能有作用,例如造血干细胞、生殖细胞、表皮基层细胞和肠腺管细胞,但这种作用可能很小,因为新生组织的干细胞比肿瘤细胞的端粒要长得多。在细胞静止期,端粒不缩短,端粒酶几乎没有活性。

42 端粒酶抑制剂对肿瘤细胞和端粒酶阳性的正常细胞的作用是不同的:肿瘤细胞对端粒酶抑制剂很敏感,作用一定时间后细胞出现生长抑制或凋亡;
生殖细胞在端粒酶抑制剂的作用下,端粒长度稍有缩短,然后继续生长,端粒不再缩短; 干细胞与端粒酶阴性的细胞相比,其端粒缩短的速度慢得多,经端粒酶抑制剂作用后,干细胞中端粒缩短的速度有所加快,一旦去除抑制剂,端粒缩短的速度又降低。

43 端粒酶抑制剂的研究进展 一、以粒酶酶RNA为靶标 通过阻断端粒酶RNA的模板作用对端粒酶活性的抑制 1、反义寡核苷酸是端粒酶抑制剂研究领域中的热点,它是与靶RNA 配对的一段短链DNA。按碱基配对原理与靶RNA 形成杂合体,被动和主动地抑制RNA 的转录。 2、核酶对端粒酶活性的抑制，核酶是具有特殊核酸内切酶活性的小分子RNA，通过催化中心的反义序列识别靶位。核酶有望成为广谱，低毒，高效的抗癌新药。

44 二、抑制端粒酶逆转录酶活性 1、hTERT 突变 在体内和体外实验中,hTERT 突变后端粒酶活性均明显被抑制。 端粒酶抑制剂诱导端粒进行性缩短,当细胞端粒缩短到临界点时细胞进入凋亡期。 2、逆转录酶抑制剂 ( reverse transcriptase inhibitors ,RTI) 由于端粒酶是RNA 依赖的DNA聚合酶,所以RTI可以成为肿瘤治疗药物。其中对于齐多夫定的研究最多。 3、靶向hTERT mRNA的ASODN 针对hTERTmRNA 设计的ASODN 能选择性地与靶基因杂交,阻断靶基因的表达。

45 三、G四联体的稳定 端粒3′端突出链富含鸟苷,在体外可形成四链DNA 结构,称为G四联体。形成G四联体后端粒酶活性受到抑制。因此,能稳定G四联体的药物就可能是有效的端粒酶抑制剂。已发现很多此类化合物,这些药物可以抑制端粒酶,但尚无缩短端粒的报道。 四、小分子抑制剂 通过分子结构模拟软件进行拟合分析，或通过其他高通量模式快速筛选端粒酶的小分子抑制剂是近年来发展较快的一个领域,此方法是基于化学结构的生物信息学策略去搜寻先导化合物,用这一策略已发现了几个端粒酶抑制剂(例如FJ5002) ,但其作用机制尚不清楚。

46 问题与展望 一、问题 1、检测方法在临床的可操作性及稳定性； 2、缺乏灵敏度和特异性高的定量准确的检测方法；
 一、问题 1、检测方法在临床的可操作性及稳定性； 2、缺乏灵敏度和特异性高的定量准确的检测方法； 3、端粒和端粒酶新组分的克隆和鉴定； 4、肿瘤细胞的端粒维持及调控机制； 5、端粒酶动力学、端粒酶作用及调控的确切机制。 6、部分肿瘤细胞有较长的端粒（>10kb）,随细胞有丝分裂，端粒缩短是个缓慢的过程，这种情况下端粒酶抑制剂是否有效尚待进一步证实。

47 二、研究展望 大量实验表明，端粒酶可有效地调控端粒的长度，而端粒的长度直接对细胞的增殖或凋亡起作用，从而决定人体寿命的长短。随着对端粒、端粒酶结构和端粒酶激活及调节机制的深入研究,端粒酶与人类衰老和肿瘤发生、发展的关系将进一步明确; 如何将端粒酶检测作为肿瘤诊断标记仍是今后研究的方向。 同时进一步探讨端粒、端粒酶和衰老因素、长寿因素之间的关系，以及开展克隆人端粒基因等科研课题对于研究人体衰老与抗衰老有着十分重要的意义。

48 谢谢！