实验十 细胞融合与血红细胞渗透性的观察 实验1: 细胞融合实验及观察 实验2: 红细胞膜渗透性观察.

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1 实验十 细胞融合与血红细胞渗透性的观察 实验1: 细胞融合实验及观察 实验2: 红细胞膜渗透性观察

2 实验1 细胞融合操作与观察 细胞融合（cell fusion）又称细胞杂交（cell hybridization），是指在自然条件或利用人工（生物的、物理的、化学的）方法，使两个或两个以上的细胞融合成一个具有双核或多核细胞的现象。此杂交细胞具有很强的生命力，增殖旺盛。 细胞融合术是细胞遗传学、细胞免疫学、病毒学、肿瘤学等研究的一重要手段，也是制备单克隆抗体杂交瘤细胞株的重要技术。

3 一、实验目的 了解细胞融合的原理、意义； 了解细胞融合的方式； 初步掌握聚乙二醇法诱导细胞融合的实验方法。

4 二、细胞融合基本原理 在诱导物（如仙台病毒，聚乙二醇）作用下，细胞发生凝集，随后在质膜接触处发生质膜成份的一系列变化，主要是某些化学键的断裂与重排，最后打通两质膜，形成双核或多核细胞（此时称同核体或异核体）。 同核体 同一个体（基因型相同）的亲本细胞 异核体 不同个体（基因型不同）的亲本细胞

5 细胞融合的意义 我们知道，无论是远缘杂交还是利用多倍体技术都要先实现有性杂交，而亲缘关系较远的物种间杂交往往表现为杂交不亲和或不能受精或是胚胎早期败育。 克服远缘杂交中的不亲和障碍； 优良性状改良； 组合起各种植物的优良遗传性状，从而培育出理想的新品种。 进行体细胞融合就可以避开生殖细胞的受精过程。在亲缘关系更远的物种间实现建基因转移，创造出自然界没有的新物种。

6 实例 白菜 甘蓝 白菜－甘蓝 马铃薯和番茄通过细胞融合得到了至今有性杂交未能获得的属间杂种薯番茄和番茄薯；
白菜和甘蓝通过细胞融合得到白菜—甘蓝。 白菜 甘蓝 白菜－甘蓝

7 细胞融合方式 自发产生 人工诱导产生 生物法：灭活的病毒 化学法：聚乙二醇(PEG） 物理法: 电融合

8 方式一：病毒诱导融合 优点：融合率较高，对各种动物细胞都适宜，且仙台病毒能在鸡胚中大量繁殖，容易培养。
很多种类的病毒能介导细胞融合,如仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒、牛痘病毒等，其中仙台病毒最常用。这类病毒的被膜中有融合蛋白，可介导病毒与宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞融合。用作融合剂的病毒必须事先用紫外线或β-丙内酯灭活，使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。 优点：融合率较高，对各种动物细胞都适宜，且仙台病毒能在鸡胚中大量繁殖，容易培养。 缺点：病毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并且制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。

9 方式二：化学诱导融合 很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇（PEG）、 二甲亚砜、甘油、山梨醇等。
方式二：化学诱导融合  很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇（PEG）、 二甲亚砜、甘油、山梨醇等。 这类物质导致细胞膜脂分子排列的改变，在去除作用因 素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中由于 接口处双分子层质膜的相互亲合和表面张力，使相接触 的细胞发生融合。 优缺点：使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较 高，但是它有一定毒性，对有些细胞（如卵细胞）不 适用。

10 方式三：电融合 20世纪80年代建立起来的电融合技术，是将两种细胞的混合液置于低压交流电场中，细胞极化成偶极子，排列成串珠状，然后施加瞬间强脉冲，使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。 具有融合的频率高，具有对细胞无毒害作用、操作简便、作用机制明确、可重复性好等优点，但难以控制一对细胞的融合。 电融合仪

11 聚乙二醇法的原理 聚乙二醇 (Polyethylene glycol，PEG) ：化学结构HO(CH2CH2O)nH ，无色无臭粘稠液体至蜡状固体，溶于水、乙醇和许多其它有机溶剂，具有良好的水溶性，无毒、无刺激性。 原理：PEG分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲合以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。 优点：成本低、异核率高、不受物种限制。

12 影响融合率的因素 浓度 浓度越低，越易操作，毒性越低； 融合时间 30 s－120 s； pH值 一般以稍碱性为宜（7.4-8.0）。
分子量　分子量大，促融合能力越高； 浓度　浓度越低，越易操作，毒性越低； 融合时间　30 s－120 s； pH值　一般以稍碱性为宜（ ）。 兼顾融合率、PEG毒性和黏度，通常选用相对分子质量1000－4000，浓度在30%－50%的PEG。

13 三、细胞融合的应用 微生物原生质体融合构建新菌株 植物原生质体融合和培养技术培育新植物（薯番茄/番茄薯）
动物细胞融合用于研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、研究肿瘤发生机制等领域。

14 四、实验用品 器具: 显微镜、离心机、离心管、细滴管、载片、盖片 2. 试剂:
Alsever液：葡萄糖2.05 g，柠檬酸钠0.8 g，NaCl 0.42 g，加重蒸水至100 mL。 GKN 液：NaCl 8 g，KCl 0.4 g，Na2HPO4.2H2O 1.77 g，NaH2PO4.2H2O 0.69 g，葡萄糖2 g，酚红0.01 g，溶于1 L重蒸水中。 0.85% NaCl液 50%聚乙二醇(PEG)：称取一定量的PEG(MW=4000)放入刻度试管，在酒精灯火或沸水中加热溶化。待冷至50℃时，加入等体积并预热至50℃的GKN液混匀。

15 五、实验内容及方法 用注射器取2 mL Alsever液，再从翼下静脉取鸭血2 mL，注入管内，再加6 mL Alsever液，混匀后置4℃冰箱中备用。 实验时取“步骤1”液1 mL于离心管中，加入4 mL 0.85%的NaCl液，混匀平衡后，以1200 rpm/min离心5分钟。 弃上清液。再重复“步骤2”两次，最后一次离心10分钟。 在沉降血球中加入1 mL GKN液，混匀使之成为细胞悬液。 用40 µm滤膜过滤细胞悬液。 取0.1 mL“5”液于1.5 mL离心管中，用于对照；剩余“5”液于另一1.5 mL离心管中，加入6-8滴（约0.5 mL）50%的PEG液，迅速混匀，常温下2-3 min滴片镜检。

16 六、结果观察与分析 在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸭血细胞膜融合在一起，形成一个融合细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸭血细胞。

17 融合率的计算 在高倍镜下随机计数200个细胞(包括融合的与未融合的细胞)，融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核)即得出融合率。 作业：描述显微镜下细胞融合的变化，计算融合率。

18 实验2、红细胞膜渗透性观察 一、实验原理 二、实验器械及试剂
细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构，它可选择性地让某些物质进出细胞。而对于不同性质的物质，细胞膜的通透性是大不一样的。当细胞与所处的环境存在渗透压差别时，水分子可从渗透压低的一侧向高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，细胞会失水而皱缩；而在低渗环境中，细胞会吸水膨胀直至破裂。 二、实验器械及试剂 显微镜，烧杯，试管，载玻片，盖玻片，兔血，1.5% NaCl溶液，蒸馏水等。

19 三、实验步骤 (一)兔红细胞渗透压的观察 1.取一小烧杯，用肝素液（1 mg/mL生理盐水）湿润，然后加入兔血，以10倍生理盐水稀释，制成兔血细胞悬浮液. 2.取5支试管，编码后依次向各试管加入1.5% NaCl溶液5, 3, 2, 1, 0 mL,然后分别加入蒸馏水，使每管总体积达到5 mL，配成一浓度梯度的NaCl溶液。 3.向每一试管加入0.5 mL兔红细胞悬浮液，混匀。 试管编号 实验项目 1.5% NaCl（ml） 蒸馏水（ml） NaCl浓度（%） 细胞形态及溶血情况

20 四、实验结果 记录分析兔红细胞渗透压变化引起的细胞形态变化及溶血情况。