医学细胞生物学实验 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备与观察 徐志浩 15294858210 遗传与基因工程教研室 院系楼西侧一楼 2016年.

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1 医学细胞生物学实验 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备与观察 徐志浩 遗传与基因工程教研室 院系楼西侧一楼 2016年

2 医学细胞生物学实验 实验目的 掌握小鼠骨髓细胞染色体标本制备的原理和方法； 掌握小鼠骨髓细胞染色体的基本特征。

3 实验原理 染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。细胞分裂中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色体观察的最佳时期。
医学细胞生物学实验 实验原理 染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。细胞分裂中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色体观察的最佳时期。 怎样才能制备一个好的染色体标本？ 获得大量处于有丝分裂中期的细胞。 使细胞破裂，且染色体能够完整并较分散的释放出来。

4 实验原理 骨髓细胞：细胞数量较多，取材方便，具有高度分裂能力和较强的分裂活性，可直接观察到分裂细胞，是研究动物细胞遗传学的好材料。
医学细胞生物学实验 实验原理 骨髓细胞：细胞数量较多，取材方便，具有高度分裂能力和较强的分裂活性，可直接观察到分裂细胞，是研究动物细胞遗传学的好材料。 秋水仙素：可以抑制细胞分裂时的纺锤体形成，使处于增殖状态的细胞停止在有丝分裂中期。注射到动物活体内，可以富集到较多的中期分裂相的骨髓细胞。 低渗：使细胞吸水膨胀，增加细胞膜的脆性。固定：维持细胞形态并消除染色体周围的杂蛋白。 悬空滴片：破碎细胞，染色体贴附在载玻片上。 这种骨髓染色体制片方法简单，取材容易，不需无菌条件，方便易行。

5 医学细胞生物学实验 试剂 100μg/ml秋水仙素：秋水仙素5mg，加5ml灭菌的生理盐水，即成1mg/ml秋水仙素溶液，于冰箱中闭光保存备用，使用时可用生理盐水稀释到100μg/ml固定液； 甲醇：冰醋酸=3：1（现配现用）； 低渗液：0.075mol/L KCl（提前37℃预热）； Giemsa染液工作液：Giemsa原液用磷酸缓冲液（pH6.8）稀释（1：10） （工作液现配现用）。

6 操作步骤 关键步骤：秋水仙素处理、低渗、单细胞悬液制备、滴片
医学细胞生物学实验 关键步骤：秋水仙素处理、低渗、单细胞悬液制备、滴片 1、动物预处理：取材前3~4h，按每克体重2~4μg腹腔注射100μg/ml的秋水仙素。 5、固定：弃上清，再加 固定液至5ml，吹打混匀，室温固定20分钟，离心同上。弃上清液，加0.2~0.4ml固定液，混匀成单细胞悬液。 2、收集骨髓细胞：颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取出股骨，用纱布剔除肌肉，剪掉股骨两端，用带针头注射器吸取8ml低渗液，冲取骨髓细胞至离心管中，反复冲洗直至骨髓腔变白为止。 6、滴片：取预先冰冻的干净载玻片，在≥30cm的高度，滴上2~3滴细胞悬液，向同一方向吹气，使细胞分散均匀，迅速在酒精灯上快速烤干，不要过热。 秋水仙素用量要注意,太多或处理时间过长，会导致染色体的过分凝缩或着丝点裂解，最终会引起染色体形态不正常，甚至被破坏或溶解。 低渗处理很关键。低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗过度，细胞会破裂；低渗不足则染色体在一起，分散不开。 4) 离心速度或离心时间也能影响染色体标本的制备。离心速度过大或离心时间过长，则会引起细胞破裂；反之，离心速度过小或离心时间过短，则细胞沉降不下来，则会引起大量细胞的丢失。 5) 固定液要随用随配，固定彻底后再打散细胞团块，否则细胞容易破碎，染色体分散亦受到影响。 6) 载玻片要预冷.冷却不够，则会影响染色体的附着和铺展。 7) 用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔，用力过大则会造成细胞破裂，而染色体也会弥散在溶液中，在随后的离心中将会丢失。 8) 滴片时的高度很重要，高度过低细胞不会破裂；过高则染色体过于分散甚至丢失，无法辨别出染色体的准确数量。 把动物细胞置于低渗液（如低浓度的KCl溶液或蒸馏水）中，使动物组织细胞充分吸水膨胀，染色体分散，平整地铺展在载玻片上，再用火焰干燥让染色体紧贴在载玻片上。这就是低渗火焰干燥法。此法有效地克服了压片法中存在的染色体分散不开、平展不良等的不足 预固定：终止低渗； 固定：杀死细胞，停止增值，防止离心时细胞间的相互粘连 低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，例如水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65M）、氯化钾（0.075M）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075M KCl为低渗液（具体情况取决于实际操作），其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短，②用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37℃，15－25分钟，以预实验条件为准。 冰冻的冷载玻片：细胞从高空坠落，碰到玻片破裂，遇冷细胞膜更易破裂使染色体散出 3、低渗处理：用吸管轻轻吹打成细胞悬液，置37℃低渗30min，中间吹打一次。 4、预固定：加1ml固定液（现配现用），吹打混匀，1000rpm离心8分钟。（终止低渗） 7、染色镜检： Giemsa染液染色8~10min，用缓慢的流水冲洗去多余染液，晾干，显微镜下观察。

7 医学细胞生物学实验 小鼠腹腔给药

8 颈椎脱臼法 在蜡盘中操作 固定颈部，斜向上30-45o 拉伸尾巴。 医学细胞生物学实验 小鼠一般不会咬人，但取用时动作也要轻缓。
先用右手抓住鼠尾提起，放在实验台等粗糙表面，在其向前爬行时，用左手的拇指和食指抓住小鼠的两耳和头颈部皮肤。

9 医学细胞生物学实验 颈椎脱臼法

10 医学细胞生物学实验 股骨

11 医学细胞生物学实验

12 医学细胞生物学实验 股骨头

13 医学细胞生物学实验 股骨头

14 收集骨髓细胞 沿虚线剪去两端股骨头，暴露骨髓腔，再用注射器吸取低渗液冲洗骨髓。 反复冲洗。 至骨髓腔发白为止。 收集到离心管中。
医学细胞生物学实验 收集骨髓细胞 沿虚线剪去两端股骨头，暴露骨髓腔，再用注射器吸取低渗液冲洗骨髓。 反复冲洗。 至骨髓腔发白为止。 收集到离心管中。

15 医学细胞生物学实验

16 医学细胞生物学实验 滴片、烤片 冰片：黏连性、延展性 悬空滴片 滴1~2滴于玻片上，吹气 在酒精灯火焰过火2~3次，勿过热。 预冷的冰片

17 医学细胞生物学实验 离心机

18 离心机的使用方法 离心机水平放置。 检查：调速旋钮是否处在零位，套管是否完整无损和垫有橡皮垫。 配平离心管。
医学细胞生物学实验 离心机的使用方法 离心机水平放置。 检查：调速旋钮是否处在零位，套管是否完整无损和垫有橡皮垫。 配平离心管。 等质量对称放置离心管，转头拧紧，盖紧盖子。 打开电源，调节离心时间，最后缓慢调节转速，离心过程中需要人员值守。 待离心机自行减速停止转动后，方可打开盖子，取出离心样品后要避免晃动离心管。 清扫并保养。

19 医学细胞生物学实验 小鼠骨髓染色体标本 将制好的玻片置于显微镜下，首先观察标本的制备效果，检验操作过程是否正确。一般来说，制得好的标本应是细胞多、颜色为紫红色。此时间期细胞由于低渗和固定处理，细胞膜和质已被去掉，镜下看到的仅为膨胀后呈圆形的细胞核。分裂期细胞染色体集中在一起，其外也无细胞膜包裹，染色体之间无重叠，易分辨，臂的长度适中。但最重要的是分裂相要多。分裂相的多少主要取决于秋水仙素的用量和时间。秋水仙素还影响染色体的形态，如用量过大，常使染色体过于缩短，不利于观察。 小白鼠的染色体数目（2n）为40条，但全部为端着丝粒染色体，大小区别不明显，较难分组编号，一般为“U”、“V”形

20 医学细胞生物学实验 小鼠骨髓染色体标本

21 医学细胞生物学实验 小鼠骨髓染色体核型特征 2n=40 端着丝粒染色体，U型或V型

22 注意事项 掌握好秋水仙素的浓度和处理时间； 离心需要配平； 小鼠骨髓要冲洗干净，以收集足够的骨髓细胞；
低渗处理是实验成败的关键，注意低渗时间； 固定液要现配现用，固定要充分； 载玻片要洁净并预冷，滴片要有一定的高度； 细胞悬液不能太稀，要呈乳白色； 烤片时温度不能太高。 秋水仙素用量要注意,太多或处理时间过长，会导致染色体的过分凝缩或着丝点裂解，最终会引起染色体形态不正常，甚至被破坏或溶解。 低渗处理很关键。低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗过度，细胞会破裂；低渗不足则染色体在一起，分散不开。 4) 离心速度或离心时间也能影响染色体标本的制备。离心速度过大或离心时间过长，则会引起细胞破裂；反之，离心速度过小或离心时间过短，则细胞沉降不下来，则会引起大量细胞的丢失。 5) 固定液要随用随配，固定彻底后再打散细胞团块，否则细胞容易破碎，染色体分散亦受到影响。 6) 载玻片要预冷.冷却不够，则会影响染色体的附着和铺展。 7) 用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔，用力过大则会造成细胞破裂，而染色体也会弥散在溶液中，在随后的离心中将会丢失。 8) 滴片时的高度很重要，高度过低细胞不会破裂；过高则染色体过于分散甚至丢失，无法辨别出染色体的准确数量。 把动物细胞置于低渗液（如低浓度的KCl溶液或蒸馏水）中，使动物组织细胞充分吸水膨胀，染色体分散，平整地铺展在载玻片上，再用火焰干燥让染色体紧贴在载玻片上。这就是低渗火焰干燥法。此法有效地克服了压片法中存在的染色体分散不开、平展不良等的不足 预固定：终止低渗； 固定：杀死细胞，停止增值，防止离心时细胞间的相互粘连 低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，例如水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65M）、氯化钾（0.075M）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075M KCl为低渗液（具体情况取决于实际操作），其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短，②用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37℃，15－25分钟，以预实验条件为准。 冰冻的冷载玻片：细胞从高空坠落，碰到玻片破裂，遇冷细胞膜更易破裂使染色体散出

23 医学细胞生物学实验 染色体标本的制备的应用 染色体标本的观察广泛应用于一些疾病的临床诊断中。例如白血病、恶性血液病等的诊断，也可用于观察毒性物质对机体遗传物质——染色体损伤的状况。

24 医学细胞生物学实验

25 医学细胞生物学实验

26 作业 简述小鼠骨髓细胞染色体标本制备的原理和操作过程。
医学细胞生物学实验 作业 简述小鼠骨髓细胞染色体标本制备的原理和操作过程。 绘制小鼠骨髓染色体核型示意图。如果没有观察到有丝分裂中期分裂相的染色体，请解释实验失败的原因。