硫巴比妥酸價 (Thiobarbituric acid value, TBA)

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1 硫巴比妥酸價 (Thiobarbituric acid value, TBA)
硫巴比妥酸價是用來檢測油脂酸敗的程度，利用在油脂自動氧化所產生的丙二醛(malonaldehyde)的單烯醇官能團與TBA的亞甲基團發生反應，兩分子TBA與一分子MAD縮合除去兩分子水，即生成這種紅色素分子。該色素的最大吸收在532～535nm，次吸收在245～305nm。顏色的深淺與MDA含量成比例，因其呈色與氧化程度成比例，故得以此色定量之。 2 malonaldehyde 2019/5/10 油脂分析方法

2 Molecular Weight 220.30586 [g/mol]

3 目的 測定油脂氧化裂解產物丙二醛(malonaldehyde)之含量做為油脂氧化後期的指標。

4 原理 硫巴比妥酸價(thiobarbituric acid value；TBA value)測定原理為油脂氧化次級產物丙二醛（包括丙醛型產物）與TBA試劑反應產生紅色產物，可利用分光光度計測定532 nm (530~535 nm)吸光值計算之。丙二醛和硫巴比妥酸之呈色反應原理如下：

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6 由於該反應不是丙二醛特有反應，所以實驗進行時最好先經蒸餾去除雜質，餾出液再與TBA試劑作用。

7 藥品及材料： (一) 鹹鴨蛋熟蛋黃1 個，先以100℃烘箱加熱2 小時。
(二) 1,1,3,3-TETRAETHOXYPROPANE四乙氧基丙烷(丙二醛二乙缩醛,Mw=220.31，MDA之Mw=72.06)標準溶液（ 10 μ g / mL） (三) 0.1 N HCl 200mL (四)矽酮油(silcon oil) (anti-forming agent) (五) TBA 試劑 0.288g TBA 溶於水中，並稀釋至100mL(如不易溶解可加熱至溶，然後稀釋至100mL，相當於0.02M)。 2019/5/10 油脂分析方法

8 檢液之調製 1.精稱鹹鴨熟蛋黃約10g，磨細後，移入蒸餾瓶 2.加入10顆沸石(此步驟可省略) 3.加0.1N HCl 100mL 4.加0.5-1 mL矽酮油 (anti-forming agent) 5.組裝蒸餾裝置小心裝妥並固定之。 6. 以溫火加熱並收集餾出液約35mL 7.移入50mL定容瓶 8.加蒸餾水定容至50mL，供做檢液。 2019/5/10 油脂分析方法

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11 丙二醛檢量線的製作 配製四乙氧基丙烷標準溶液(10 μg/mL) 50 mL：秤取0.1 g四乙氧基丙烷以0.01N HCl溶液溶解，再加去離子水定量，調整濃度為100 μg/mL儲存，使用時再以去離子水稀釋至10 μg/mL。 精確量取上述四乙氧基丙烷鹽酸溶液（每毫升含丙二醛10 μg）2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL及蒸餾水（空白試驗）分置50 mL定量瓶，各加蒸餾水至標線。

12 另取150 mL試管做上記號，分別置入上述標準溶液及TBA試劑各3 mL，混合均勻，置沸水浴加熱30分鐘，取出放冷，測定532 nm吸光值。
由所得吸光值及相對之丙二醛標準溶液的含量繪製檢量線，並求其斜率、截距及相關係數。

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14 檢液之調製 稱取鹹鴨熟蛋約10~15 g置於蒸餾瓶中，加入0.1N HCl溶液100 mL，依普通蒸餾裝置小心組裝並固定。

15 丙二醛含量測定 取150mL試管二支（二重覆）加入樣品溶液及TBA各3 mL混合均勻（做二重覆），置沸水浴加熱30分鐘取出放冷，測定532 nm吸光值。 測得吸光值代入迴歸方程式，求出丙二醛含量(a)。 代入公式計算鹹鴨蛋中丙二醛含量(ppm)。

16 分光光度計操作步驟 按A/T/C鍵，選擇%T（穿透度）模式。
以100/010/001三顆按鍵，輸入測定波長(532 nm)，100代表百分數(0…9)、010代表十位數(0…9)、001代表個位數(0…9)。 在測試槽放入「空白溶液」(blank solution)，並關閉上蓋。 按下Blank鍵，螢幕會出現100%T。 取出空白溶液，按A/T/C鍵，選擇A（吸收值）模式。 將樣品放入測試槽，記錄讀值。

17 在15mL試管中加入step 2 之TEP (mL)
標準曲線製作和樣品之呈色 丙二醛(MAD)標準儲備液：精確稱取1，1，3，3-四乙氧基丙烷（E.Mesck 97%）0.315g，溶解後稀釋至1000mL（MAD含量為100μg/mL），置冰箱保存。 MAD工作液：精確移取上述儲備液10mL稀釋至100mL（MAD=10 μg/mL）置冰箱備用。 STEP 編號 B 1 2 3 4 5 S1 S2 MAD標準液( 10μg/mL) 體積(mL) 6 8 10 --- 以水定容至50mL (total μg) 20 40 60 80 100 此時MAD終濃度(μg/mL) 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 在15mL試管中加入step 2 之TEP (mL) 加樣 3mL 加TBA(mL) 混合均勻 V 沸水浴加熱30 分鐘 7 取出放冷(流水冷卻5min) 532nm 測吸光度(Y軸座標) 0.27 0.24 9 X軸座標(MDA, μg) 2.4 3.6 4.8 6.0 2019/5/10 油脂分析方法

18 在15mL試管中加入step 2 之TEP (mL)
標準曲線製作和樣品之呈色 標準液之製備 精確量取 四乙氧基丙烷（ tetraethoxy propane, TEP）0.05g 0.1N鹽酸溶液(或水)定容至50mL（含TEP 1mg/mL） 取0.5mL含TEP(1mg/mL）再以水定容至50mL（含TEP 10μg/mL） STEP 編號 B 1 2 3 4 5 S1 S2 TEP標準液( 10μg/mL) 體積(mL) 6 8 10 --- 以水定容至50mL V 此時TEP終濃度(μg/mL) 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 在15mL試管中加入step 2 之TEP (mL) 加樣 3mL 加TBA(mL) 混合均勻 沸水浴加熱30 分鐘 7 取出放冷(流水冷卻5min) 532nm 測吸光度(Y軸座標) 0.27 0.24 9 X軸座標(TEP, μg) 2.4 3.6 4.8 6.0 2019/5/10 油脂分析方法

19 迴歸曲線之製作 MAD(μg) 0.0 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 3.6 4.2 4.8 5.4 6.0 OD 532nm 0.059 0.114 0.185 0.228 0.285 0.35 0.41 0.462 0.533 0.584 由所得吸光度及相對之標準溶液MAD的含量繪製迴歸曲線，並求其斜率、截距及相關係數。 2019/5/10 油脂分析方法

20 計算 C：在標準曲線上以線性方程式求出之樣品MDA(μ g) 50 ：樣品蒸餾後定容之體積(mL) V：樣品蒸餾定容後採樣體積3mL
W ：樣品之重量(g) 上式為乙級之公式，下式為修改的公式 由以上測得的吸光度及TEP濃度可得TEP標準曲線，從而得出回歸方程式。 　　Y＝0.097X－0.000 　　式中　X為相當的丙二醛量（μg） 　　　　　Y為吸光度 　MDA計算公式 　MDA（ μg /g）=X x 220/72 x ( 50 /3)/W 其中：W為樣品重（g） Y為測定樣品相當於丙二醛的量（μg） 　　　　　 例： 0.27=0.097x-0.000 X=2.78 μg MDA（ μg /g）=2.78 x 220/72 x ( 50 /3)/10 g= 14.15 2019/5/10 油脂分析方法

21 酸價: 游離脂肪酸 過氧化物價: 過氧化物 (初期氧化) TBA: 後期氧化產物