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细胞器的分级分离 [目的要求] 1．掌握差速离心法和密度梯度离心法的原理。 2．熟悉哺乳动物细胞的细胞核、线粒体分离和纯化的实验方法。
![细胞器的分级分离 [目的要求] 1．掌握差速离心法和密度梯度离心法的原理。 2．熟悉哺乳动物细胞的细胞核、线粒体分离和纯化的实验方法。](http://slidesplayer.com/slide/16774936/97/images/1/%E7%BB%86%E8%83%9E%E5%99%A8%E7%9A%84%E5%88%86%E7%BA%A7%E5%88%86%E7%A6%BB+%5B%E7%9B%AE%E7%9A%84%E8%A6%81%E6%B1%82%5D+1%EF%BC%8E%E6%8E%8C%E6%8F%A1%E5%B7%AE%E9%80%9F%E7%A6%BB%E5%BF%83%E6%B3%95%E5%92%8C%E5%AF%86%E5%BA%A6%E6%A2%AF%E5%BA%A6%E7%A6%BB%E5%BF%83%E6%B3%95%E7%9A%84%E5%8E%9F%E7%90%86%E3%80%82+2%EF%BC%8E%E7%86%9F%E6%82%89%E5%93%BA%E4%B9%B3%E5%8A%A8%E7%89%A9%E7%BB%86%E8%83%9E%E7%9A%84%E7%BB%86%E8%83%9E%E6%A0%B8%E3%80%81%E7%BA%BF%E7%B2%92%E4%BD%93%E5%88%86%E7%A6%BB%E5%92%8C%E7%BA%AF%E5%8C%96%E7%9A%84%E5%AE%9E%E9%AA%8C%E6%96%B9%E6%B3%95%E3%80%82.jpg "细胞器的分级分离 [目的要求] 1．掌握差速离心法和密度梯度离心法的原理。 2．熟悉哺乳动物细胞的细胞核、线粒体分离和纯化的实验方法。")
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[实验原理] 球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质黏度和离心力。
差速离心法（differential centrifugation）是将细胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心，较大颗粒先在低速离心时沉淀，再用高速离心沉淀上清液中的小颗粒物质，从而达到逐级分离细胞器的目的。 密度梯度离心法（density gradient centrifugation）是一定介质形成一连续或不连续的密度梯度，顶部的细胞匀浆在重力或离心力场的作用下分层、分离。一般先通过差速离心法将细胞器初步分离，再进一步通过密度梯度离心法分离纯化细胞器。
![[实验原理] 球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质黏度和离心力。](http://slidesplayer.com/slide/16774936/97/images/2/%5B%E5%AE%9E%E9%AA%8C%E5%8E%9F%E7%90%86%5D+%E7%90%83%E5%BD%A2%E9%A2%97%E7%B2%92%E7%9A%84%E6%B2%89%E9%99%8D%E9%80%9F%E7%8E%87%E5%8F%96%E5%86%B3%E4%BA%8E%E5%85%B6%E5%AF%86%E5%BA%A6%E3%80%81%E5%8D%8A%E5%BE%84%E3%80%81%E4%BB%8B%E8%B4%A8%E9%BB%8F%E5%BA%A6%E5%92%8C%E7%A6%BB%E5%BF%83%E5%8A%9B%E3%80%82.jpg "差速离心法（differential centrifugation）是将细胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心，较大颗粒先在低速离心时沉淀，再用高速离心沉淀上清液中的小颗粒物质，从而达到逐级分离细胞器的目的。 密度梯度离心法（density gradient centrifugation）是一定介质形成一连续或不连续的密度梯度，顶部的细胞匀浆在重力或离心力场的作用下分层、分离。一般先通过差速离心法将细胞器初步分离，再进一步通过密度梯度离心法分离纯化细胞器。")
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细胞器的分离常通过组织细胞匀浆、分级分离和分析三个步骤完成。
分级分离方法有两种，即：差速离心法和密度梯度离心法。
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[实验用品] 1．器具：玻璃匀浆器、低速离心机、高速冷冻离心机、天平、普通光学显微镜、1.5 ml Ep管、载玻片、10 ml滴管、冰盒、冰块、滤网、染缸、20 ml烧杯。 2．材料：大白鼠。 3． 试剂：生理盐水、PBS、0.25 mol/L的蔗糖溶液、0.34 mol/L蔗糖-0.5 mmol/L Mg(Ac)2溶液、0.88 mol/L蔗糖-0.5 mmol/L Mg(Ac)2溶液、95％乙醇、甲基绿-派洛宁染液、丙酮、0.2％的詹纳斯绿B。
![[实验用品] 1．器具：玻璃匀浆器、低速离心机、高速冷冻离心机、天平、普通光学显微镜、1.5 ml Ep管、载玻片、10 ml滴管、冰盒、冰块、滤网、染缸、20 ml烧杯。 2．材料：大白鼠。](http://slidesplayer.com/slide/16774936/97/images/4/%5B%E5%AE%9E%E9%AA%8C%E7%94%A8%E5%93%81%5D+1%EF%BC%8E%E5%99%A8%E5%85%B7%EF%BC%9A%E7%8E%BB%E7%92%83%E5%8C%80%E6%B5%86%E5%99%A8%E3%80%81%E4%BD%8E%E9%80%9F%E7%A6%BB%E5%BF%83%E6%9C%BA%E3%80%81%E9%AB%98%E9%80%9F%E5%86%B7%E5%86%BB%E7%A6%BB%E5%BF%83%E6%9C%BA%E3%80%81%E5%A4%A9%E5%B9%B3%E3%80%81%E6%99%AE%E9%80%9A%E5%85%89%E5%AD%A6%E6%98%BE%E5%BE%AE%E9%95%9C%E3%80%811.5+ml+Ep%E7%AE%A1%E3%80%81%E8%BD%BD%E7%8E%BB%E7%89%87%E3%80%8110+ml%E6%BB%B4%E7%AE%A1%E3%80%81%E5%86%B0%E7%9B%92%E3%80%81%E5%86%B0%E5%9D%97%E3%80%81%E6%BB%A4%E7%BD%91%E3%80%81%E6%9F%93%E7%BC%B8%E3%80%8120+ml%E7%83%A7%E6%9D%AF%E3%80%82+2%EF%BC%8E%E6%9D%90%E6%96%99%EF%BC%9A%E5%A4%A7%E7%99%BD%E9%BC%A0%E3%80%82.jpg "3． 试剂：生理盐水、PBS、0.25 mol/L的蔗糖溶液、0.34 mol/L蔗糖-0.5 mmol/L Mg(Ac)2溶液、0.88 mol/L蔗糖-0.5 mmol/L Mg(Ac)2溶液、95％乙醇、甲基绿-派洛宁染液、丙酮、0.2％的詹纳斯绿B。")
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[实验步骤] 1．组织匀浆制备 （1）取材 将空腹12～24 h的大鼠处死。剖开腹部， 迅速取出肝脏，用预冷的生理盐水洗净血污，用
滤纸吸干。 （2）制备匀浆 称取约1～2 g左右的肝组织，用预冷 的0.25 mol/L的蔗糖溶液冲洗数次，剪碎。以预 冷的0.25 mol/L的蔗糖溶液悬浮剪碎的组织，移 入匀浆器内，在冰浴条件下匀浆。匀浆完成后， 用滤网过滤，即制得肝细胞匀浆，备用。
![[实验步骤] 1．组织匀浆制备 （1）取材 将空腹12～24 h的大鼠处死。剖开腹部， 迅速取出肝脏，用预冷的生理盐水洗净血污，用](http://slidesplayer.com/slide/16774936/97/images/5/%5B%E5%AE%9E%E9%AA%8C%E6%AD%A5%E9%AA%A4%5D+1%EF%BC%8E%E7%BB%84%E7%BB%87%E5%8C%80%E6%B5%86%E5%88%B6%E5%A4%87+%EF%BC%881%EF%BC%89%E5%8F%96%E6%9D%90+%E5%B0%86%E7%A9%BA%E8%85%B912%EF%BD%9E24+h%E7%9A%84%E5%A4%A7%E9%BC%A0%E5%A4%84%E6%AD%BB%E3%80%82%E5%89%96%E5%BC%80%E8%85%B9%E9%83%A8%EF%BC%8C+%E8%BF%85%E9%80%9F%E5%8F%96%E5%87%BA%E8%82%9D%E8%84%8F%EF%BC%8C%E7%94%A8%E9%A2%84%E5%86%B7%E7%9A%84%E7%94%9F%E7%90%86%E7%9B%90%E6%B0%B4%E6%B4%97%E5%87%80%E8%A1%80%E6%B1%A1%EF%BC%8C%E7%94%A8.jpg "滤纸吸干。 （2）制备匀浆 称取约1～2 g左右的肝组织，用预冷. 的0.25 mol/L的蔗糖溶液冲洗数次，剪碎。以预. 冷的0.25 mol/L的蔗糖溶液悬浮剪碎的组织，移. 入匀浆器内，在冰浴条件下匀浆。匀浆完成后， 用滤网过滤，即制得肝细胞匀浆，备用。")
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2.细胞器的分级分离 (1)细胞核的分离： 第一次:1000rpm,8min。 (2)细胞核的纯化
在沉淀中加入0.34mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2至2ml，混悬。用长针头注射器在混悬液下轻轻加入2ml 的0.88mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2溶液。尽量使两种溶液明显分层。 2000rpm离心8min。 上清保留于试管1.0处 加0.25M蔗糖至4ml，混匀 重复1次 第二次:1300rpm,8min。弃上清
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(3)细胞核鉴定： 涂片：在离心后的沉淀中加入几滴PBS，混匀后涂片，空气干燥 固定：浸入95％的乙醇溶液5min，晾干
。 涂片：在离心后的沉淀中加入几滴PBS，混匀后涂片，空气干燥 固定：浸入95％的乙醇溶液5min，晾干 染色：滴加甲基绿-派洛宁染液染色15min 分色:快速放入丙酮中，蒸馏水漂洗，擦干水分 显微镜下观察结果
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(4)线粒体的分离 将分离细胞核时收集的上清以10000 g 离心10 min，将上清移入1
(4)线粒体的分离 将分离细胞核时收集的上清以10000 g 离心10 min，将上清移入1.5 ml Ep管内并置冰上或4℃冰箱待用。沉淀用0.25 mol/L的蔗糖溶液重悬后， g离心10 min，重复1次，取沉淀。 (2)线粒体的鉴定 于洁净载玻片上滴1滴0.02％～1％的詹纳斯绿B染液，用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中，染色5～10 min，盖上盖玻片，镜检。
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[结果与分析] 光学显微镜下观察，细胞核经甲基绿-派洛宁染色，DNA呈蓝绿色，核仁和胞质RNA呈红色。观察分析完整细胞核的数量及其比例。线粒体经詹纳斯绿B染色呈亮绿色。溶酶体可用酸性磷酸酶显示法鉴定。光镜下看不到溶酶体的形态特征，但可看到代表溶酶体的棕黑色颗粒或团块。如果分离到的细胞组分符合其形态学及酶学特征，而且没有其他组分的污染，则证明分离操作成功，反之则为失败。
![[结果与分析]](http://slidesplayer.com/slide/16774936/97/images/9/%5B%E7%BB%93%E6%9E%9C%E4%B8%8E%E5%88%86%E6%9E%90%5D.jpg "光学显微镜下观察，细胞核经甲基绿-派洛宁染色，DNA呈蓝绿色，核仁和胞质RNA呈红色。观察分析完整细胞核的数量及其比例。线粒体经詹纳斯绿B染色呈亮绿色。溶酶体可用酸性磷酸酶显示法鉴定。光镜下看不到溶酶体的形态特征，但可看到代表溶酶体的棕黑色颗粒或团块。如果分离到的细胞组分符合其形态学及酶学特征，而且没有其他组分的污染，则证明分离操作成功，反之则为失败。")
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[注意事项] 1．组织匀浆时，既要尽可能使细胞完全破碎，又 要尽量快速。 2．在细胞器分离过程中，所有操作应尽可能在 1～4℃下进行。
3．实验过程应注意保持细胞器的完整性，避免操 作过于剧烈。另线粒体进行的是活体染色， 要求样品制备好后尽快染色。
![[注意事项] 1．组织匀浆时，既要尽可能使细胞完全破碎，又 要尽量快速。 2．在细胞器分离过程中，所有操作应尽可能在 1～4℃下进行。](http://slidesplayer.com/slide/16774936/97/images/10/%5B%E6%B3%A8%E6%84%8F%E4%BA%8B%E9%A1%B9%5D+1%EF%BC%8E%E7%BB%84%E7%BB%87%E5%8C%80%E6%B5%86%E6%97%B6%EF%BC%8C%E6%97%A2%E8%A6%81%E5%B0%BD%E5%8F%AF%E8%83%BD%E4%BD%BF%E7%BB%86%E8%83%9E%E5%AE%8C%E5%85%A8%E7%A0%B4%E7%A2%8E%EF%BC%8C%E5%8F%88+%E8%A6%81%E5%B0%BD%E9%87%8F%E5%BF%AB%E9%80%9F%E3%80%82+2%EF%BC%8E%E5%9C%A8%E7%BB%86%E8%83%9E%E5%99%A8%E5%88%86%E7%A6%BB%E8%BF%87%E7%A8%8B%E4%B8%AD%EF%BC%8C%E6%89%80%E6%9C%89%E6%93%8D%E4%BD%9C%E5%BA%94%E5%B0%BD%E5%8F%AF%E8%83%BD%E5%9C%A8+1%EF%BD%9E4%E2%84%83%E4%B8%8B%E8%BF%9B%E8%A1%8C%E3%80%82.jpg "3．实验过程应注意保持细胞器的完整性，避免操. 作过于剧烈。另线粒体进行的是活体染色， 要求样品制备好后尽快染色。")
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[作业与思考题] 1．分别在高倍镜和油镜下观察细胞核和线粒体， 并绘制其结构图。 2．简述细胞器分级分离的实验原理和主要步骤？
3．实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得细 胞器的含量和纯度？
![[作业与思考题] 1．分别在高倍镜和油镜下观察细胞核和线粒体， 并绘制其结构图。 2．简述细胞器分级分离的实验原理和主要步骤？](http://slidesplayer.com/slide/16774936/97/images/11/%5B%E4%BD%9C%E4%B8%9A%E4%B8%8E%E6%80%9D%E8%80%83%E9%A2%98%5D+1%EF%BC%8E%E5%88%86%E5%88%AB%E5%9C%A8%E9%AB%98%E5%80%8D%E9%95%9C%E5%92%8C%E6%B2%B9%E9%95%9C%E4%B8%8B%E8%A7%82%E5%AF%9F%E7%BB%86%E8%83%9E%E6%A0%B8%E5%92%8C%E7%BA%BF%E7%B2%92%E4%BD%93%EF%BC%8C+%E5%B9%B6%E7%BB%98%E5%88%B6%E5%85%B6%E7%BB%93%E6%9E%84%E5%9B%BE%E3%80%82+2%EF%BC%8E%E7%AE%80%E8%BF%B0%E7%BB%86%E8%83%9E%E5%99%A8%E5%88%86%E7%BA%A7%E5%88%86%E7%A6%BB%E7%9A%84%E5%AE%9E%E9%AA%8C%E5%8E%9F%E7%90%86%E5%92%8C%E4%B8%BB%E8%A6%81%E6%AD%A5%E9%AA%A4%EF%BC%9F.jpg "3．实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得细. 胞器的含量和纯度？")
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