实验 土壤中微生物的分离与纯化.

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1 实验 土壤中微生物的分离与纯化

2 实验(二)、 从土壤中稀释分离微生物 一、实验目的： 学习微生物稀释平板计数及划线分离技术 初步观察细菌的菌落形态特征
学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能

3 二、实验原理 采用适宜（选择）培养基和培养条件，或加入某种抑制剂有利于目标微生物的生长，从而分离获得目标微生物的纯培养：常用稀释平板分离法和划线分离法 分离细菌用牛肉膏培养基，分离放线菌用高氏培养基，分离真菌用马丁氏-孟加拉红培养基。 在固体培养基上形成单个菌落。 依据一个单细胞在固体培养基上培养后可以长成一菌落，从而推算样品中含有多少细菌、放线菌以及真菌的活菌数目 土壤是微生物生存的大本营，种类和数量及其丰富

4 三、实验步骤： 从土壤中稀释分离微生物的方法如下： （一）土壤悬液的制备 准备1瓶土壤悬液：称10克土壤放入带玻璃珠的90 ml瓶装无菌水中，手摇振荡(10-20min)，使土样分散。

5 取一瓶牛肉膏蛋白胨培养基（350ml左右／瓶） 熔化后，待冷至55-60℃时，倒平板。
（二）倒固体琼脂培养基平板：(从此步骤开始，在超净台上操作） 取一瓶牛肉膏蛋白胨培养基（350ml左右／瓶） 熔化后，待冷至55-60℃时，倒平板。

6 (三-1)稀释平板分离法 1、悬液稀释：十倍梯度稀释法，方法见下图：

7 采用10－3，10－4，10－5稀释液各0.1ml 涂布牛肉膏蛋白胨平板
2、悬液涂布(演示): 无菌操作(从稀至浓将菌液涂布均匀) 采用10－3，10－4，10－5稀释液各0.1ml 涂布牛肉膏蛋白胨平板 (三个稀释度，每个稀释度涂布2个平板，共6个平板)

8 平板涂布 Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod. 简单易行，但易 造成机械损伤

9 (三-2) 划线分离法——平皿划线（演示） 每人用1个牛肉膏蛋白胨平板做划线分离， 从三角瓶中取土壤悬液作划线分离

10 平皿划线分离法

11 （四）吹干 将已涂布好的平皿皿盖半揭开，置于无菌台上吹干。 （五）培养： 待吹干后，将平板用报纸包好（每个平板方向一致），写上班级和姓名，皿底朝上，置于37℃培养箱培养。 （六）检查结果(48小时后)

12 实验要求 每组(5-6人) 做1个土样梯度分离 倒12个平皿 (其中6个用于稀释涂布，6个用于划线分离，即每个人2个平板)

13 结果分析: 1. 计数：（牛肉膏平板取单菌落数目在30～300个左右的稀释度来计数) 我所计数的平板稀释度是： 单菌落数目： 、 。 2.计算：活菌数目/每克土壤＝ （计算过程）＝ 菌落形成单位(CFU)/每克土壤(用科学计数法表示) [每克土壤中菌落形成单位数＝同一稀释度2次重复的平均菌落数×稀释倍数×10] 3. 对本组和其它小组的细菌计数结果进行分析

14 实验报告 从土壤中稀释分离微生物的原理、方法、步骤 2．思考题 1.你所做的涂布平板和划线平板是否较好的得到了单菌落，如果不是，请分析原因； 2.怎样判断稀释涂布平板记数数据是否可靠？需要掌握哪几个关键？ 3.平板菌落记数法中，为什么熔化后的培养基要冷却至50-60度左右才能倒平板？