生物化学与分子生物学实验.

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1 生物化学与分子生物学实验

2 生物化学实验室规则 1、实验前需预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期的结果、操作关键步骤及注意事项。
2、实验要严肃认真地按照操作规程进行，注意观察实验中出现的现象和结果，并把实验数据和结果及时如实记录在实验记录本上，课后根据实验结果进行科学分析。 3、实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，仪器洗净放好。 4、注意节约药品、试剂和各种物品，爱护仪器，按规程操作仪器，以免损坏。 5、实验室严禁吸烟！乙醇、丙酮等易燃物品不能直接加热，并远离火源。实验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。 6、若发生酸碱灼烧事故，应用大量自来水冲洗，酸灼伤者用饱和NaHCO3溶液中和，碱灼伤者用饱和H3BO3溶液中和，氧化剂伤害者用Na2S2O4处理。 7、所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾桶中。强酸、强碱必须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。

3 实验考试和考核方法 实验分数占总分的15％，其中理论考试占5分，见理论考试试卷。 每次实验为2.5分，其中：
1、实验报告占1分（实验的报告占0.5分，分析讨论0.5分。）。 2、实验结果占0.4分（结果的正确度），操作考核占0.4分：包括分光光度法测试，离心机使用，层析法，电泳法等基本操作。实验态度占0.7分。

4 实验报告要求 1、实验题目，时间，实验者姓名 2、目的 3、原理（简单明了） 4、操作不写 5、结果，定性要分析，定量要列表
6、结论：总结分析

5 试剂使用规则 1、使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。
2、取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。 3、取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用干净吸管吸取标准液，以免污染瓶中的标准液体。 4、使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。 5、使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。

6 使用过的玻璃仪器的清洗 1、一般非计量玻璃仪器或粗容量仪器，如烧杯、试管、量筒等先用肥皂水刷洗，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1－2次，倒置晾干。 2、容量分析仪器，如滴定管、容量瓶等先用自来水冲洗，沥干后，浸于铬酸洗液浸泡数小时。然后用自来水反复冲洗干净，干燥备用。 3、用完比色杯后，立即用自来水反复冲洗。切忌用刷子、粗糙的布或纸擦拭。洗净后，倒置晾干备用。

7 吸量管的种类和使用 1、分类 1）奥氏吸量管 供准确量取0.50、1.0、2.0、3.0ml液体所用。这种吸量管只有一个刻度，当放出所量取的液体时，管尖余留的液体必须吹入容器内。 2）移液管 常用量取50.0、25.0、10.0、5.0、2.0、1.0ml的液体，这种吸量管只有一个刻度，放液时，量取的液体自然流出后，管尖需在容器内滞留15秒。注意管尖残留的液体不要吹出。 3）刻度吸量管 供量取10 ml以下任意体积的溶液。一般刻度包括尖端部分。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，吸量管上端标有“吹”字。未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。 2、使用原则 量取整数量液体，并且取量要求准确时，应该选用奥氏吸量管。量取大体积时要用移液管。同一定量实验中，如欲加同种试剂于不同的管中，并且取量不多时，应选择一支与最大取液量接近的刻度吸量管。

8 吸量管的使用 1、正确拿法 中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端
1、正确拿法 中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端 2、取液 用橡皮球吸液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上端。 3、调刻度 吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。 4、放液 吸量管移入准备接受溶液的容器中，仍使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。奥氏吸量管和刻度到底的吸量管应吹出尖端残留的液体。移液管应最后靠壁15秒。

9 一、分光光度法 原理 光的本质是一种电磁波，具有不同的波长，可见光的波长范围在400～760nm。波长范围200～400nm的光线称为紫外光。 有色物质可以选择性地吸收一部分可见光的光能量而呈现不同颜色，某些物质却能特征性地选择吸收紫外光的能量。

10 物质吸收由光源发出的某些波长的光可形成特定的吸收光谱。由于物质的吸收光谱与物质的分子结构有关，而且在一定的条件下其吸收程度与该物质的浓度成正比，所以可利用物质的特定吸收光谱对其进行定性和定量的分析。分光光度法就是利用各种物质所具有的这种吸收特征所建立起来的分析方法。

11 吸收光谱和物质的定性分析 用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度（Absorbance），然后以波长（λ）为横轴，相应的吸光度（A）为纵轴，按结果作图，可得到该物质的吸收光谱曲线。吸收光谱曲线是物质的特征曲线。在一定的温度、pH值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（λmax）。物质不同，它们的最大吸收波长也往往不同。

12 物质用分光分析定性主要根据是吸收光谱存在的特征吸收。
常用定性方法： 1、比较吸收光谱曲线。 2、比较最大吸收波长。 3、比较吸光度比值。

13 Beer—Lambert定律和物质的定量分析
原理 一束平行光照射至溶液时、一部分光被吸收、一部分光可透过该溶液、不同物质光的吸收程度是不同的。物质对单色光吸收的强弱以及溶液浓度与也曾厚度的关系，服从物质对光吸收的定量定律，即Beer—Lambert定律，其表达式为： A＝KCL 或Lg I0/I＝KCL Beer—Lambert定律的含义为一束单色光通过溶液解质后，光能被吸收的程度与溶液的浓度和厚度成正比。如果实验中的厚度不变，则A＝KC A为吸光度，T为透光度，即I/I0，A和T是负对数的关系。 吸收系数K实际上式物质在单位浓度和单位厚度下对入射光的吸光度，在一定波长下，K越大，表示物质对光的吸收越强。

14 常用的以Beer—Lambert定律为依据的定量分析方法
1、标准曲线法。配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按一定方法显色后，分别用分光光度计测得吸光度。以吸光度为纵座标、浓度为横座标，绘制A—C曲线，即标准曲线。在相同条件下，测定被测溶液得吸光度，从标准曲线上可找出相应的浓度。标准曲线制作与测定管的测定应在同一仪器上进行。

15 2、标准管法。将标准品（已知浓度Cs）与样品在相同条件下显色并测得吸光度。因为在此下，两者的K值相等，所以可根据 Cx＝(Cs/As) Ax 求得样品溶液得浓度Cx。式中As和Ax分别为标准管测定 管的吸光度。 3、克分子吸光系数ε法。当浓度为IM，溶液厚度为1cm，吸光系数用ε表示，ε亦称为克分子吸光系数。在已知ε得情况下，可根据下式求出测定液的物质浓度 C＝A/ε

16 分光光度计 光源 单色器 受光器 测量器 样品室 原理：分光光度计形式较多，但基本结构和原理相似，可用下图表示：
仪器中光源经过单色器中的单色原件（如棱镜），所得到的单色光（入射光）进入样品室，透出的光被受光器（光电池或光电色）产生光电流，放大后在测量仪上显示出吸光度（A）或透光度（T） 仪器的光电管或光电池对不同波长的光敏感度不一样，在制作吸收曲线时应注意每换一次波长，都应将空白溶液的吸光度调整到0。 光源 单色器 受光器 测量器 样品室

17 分光光度计的类型 1、单波长单光束分光光度计 2、单波长双光束分光光度计 3、双波长分光光度计
最简单常见的光度计是单波长单光束分光光度计，如751、721等。

18 使用方法 （以721为例） 该机的光谱范围在360nm-800nm。 1、接通电源，打开机器开关，使仪器通电，打开箱盖，预热10分钟。
2、将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用软纸擦清外壁，放入样品室。 3、调节电流计上零点调节器，使读书盘上指针的吸光度为∝或透光率为0。调节测定所用波长。 4、盖上箱盖，光径开关自动打开。转动光量调节器使空白或对照管的吸光度为0，或透光率为100％，待读数指针稳定后，逐步拉出样品盒滑干，通过读数指针，读取测定管上的吸光度。有时需调节灵敏度开关，才能正确读得吸光度。此时应重新转动零点调节器至吸光度为∝。 5、读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净。 6、溶液定量测定时，应注意吸光度在0.1～1.0范围，浓度太大时应适当稀释。 *注意事项：1）用手拿比色杯的磨砂面。 2）液体的体积装满比色杯的3/4。 3）不要将比色杯放在分光光度计上。

19 可见光紫外光光度计 该种机采用两个光源，可在可见和紫外区对物质进行分析，钨丝灯发出光的适宜范围在360－1000nm，氢灯发出光的适宜范围在150－400nm。 通过两种光源的切换，可以在两种波长范围内使用。

20 实验一 高锰酸钾吸收曲线的绘制 原理 高锰酸钾水溶液对于不同波长的光线可有不同的吸收程度。用721分光光度计测定相应波长下的高锰酸钾吸光度并作图，可得到吸收曲线。

21 实验二 双缩脲（Biuret）法测定蛋白质含量
原理 在碱性溶液中，蛋白质分子能与铜离子结合生成紫红色的化合物（双缩脲反应），在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线形关系。因此可用比色法测定蛋白的含量。