单个核细胞分离及 T细胞亚群测定.

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1 单个核细胞分离及 T细胞亚群测定

2 外周血单个核细胞分离 密度梯度离心分离法,根据血细胞本身比重的差别来分离各种细胞.
外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞.其比重为 Ficoll分离液比重为1.077±0.002，主要用于分离外周血单个核细胞.

3 不同细胞密度不同 人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为

4 密度梯度离心(Ficoll)离心　

5 用1.077±0.001的分层液可将细胞分离 　

6 操作步骤 在刻度离心管内装入2mlFicoll分层液，沿管壁加入3-4ml肝素抗凝全血，使其轻轻叠加于分层液上面，离心2000rpm，30min 吸取单个核细胞(白膜层)于干净的刻度玻璃管内，加入Hank‘s液至8ml，重悬后混匀离心，1500rpm，15min，重复洗涤2次 末次离心后去除上清，用含20%小牛血清的Hank’s液调整细胞浓度约2×106左右

7 注意事项 实验中的细胞得率与室温及分层液比重等有关，室温超过25℃时可影响细胞得率。 加入血液至淋巴细胞分离液时，应保持两层液体的清晰界面。
离心时，启动和停止动作要缓慢。 吸取淋巴细胞时，操作手法要轻、稳、准

8 各组需领取的器材 肝素抗凝全血标本1份 一次性吸头数根 装有Ficoll的离心管1支(分离用) 空白离心管1支(洗涤用)
用烧杯取50ml Hank’s液 已溶于Hank’s液的小牛血清

9 花环试验测定外周血T细胞亚群 E花环形成试验是根据人的T细胞表面有绵羊红细胞受体一E受体(E即红细胞erythrocyte)，在一定条件下能与绵羊红细胞(SRBC)结合，绵羊红细胞吸附于T细胞周围，形如玫瑰花环,因而得名。此试验既能计数T细胞，又能反映T淋巴细胞活性,从而可以判定机体细胞免疫水平。

10 原 理 成熟的T淋巴细胞表面表达有CD3/CD4或CD3/CD8抗原，而结合在红细胞上的抗CD3/CD4/CD8单抗可以分别与淋巴细胞表面的CD3/CD4/CD8相结合，通过抗原抗体复合物的桥联作用使得红细胞与T细胞结合形成花环，达到指示效果。

11 实验步骤 制备OKT溶液:用Hank’s液溶解OKT试剂,将其加入刻度离心管,用Hank’s液将体积加至8ml,离心1500rpm,15min 去除上清,用0.5ml含20%小牛血清的Hank’s液重悬OKT试剂(已制备好) 分别在OKT3,OKT4,OKT8反映管加入40ul相应的OKT单抗和40ul的细胞悬液,冰箱中过夜. 取少量反应液均匀涂于玻片上,自然干燥，用Wright—Giemsa染液染色，加等量的PBS缓冲液,镜下观察染色情况并适时用PBS冲洗后观察湿片. 在显微镜下，淋巴细胞呈蓝色，SRBC红色,一个淋巴细胞周围凡吸附三个或三个以上SRBC即为E花环形成.计数200个淋巴细胞，计算花环形成百分率。

12 实验结果 E花环形成率（%）＝ ×100%

13 E花环示意图 羊红细胞 T淋巴细胞

14 注意事项 计数及摇匀细胞时动作应轻柔，避免打散已形成的花环 反应管应使用玻璃管,不能用塑料管.

15 Hank’s液配方-甲液 NaCl 80g KCl 4g MgS04·7H20 1g MgCl2·6H2O 1g CaCl2 1.4g
溶于500ml双蒸水

16 Hank’s液配方-乙液 Na2HP04·12H20 1.52g KH2P04 0.60g 葡萄糖 10.00g
酚红 g溶解于0.1mol/L NaOH 10ml 双蒸水加至500ml

17 Hank’s液配方-应用液 取甲液10ml和乙液10ml,加双蒸水至200ml 使用前,用弱碱调整PH为7.2左右

18 思考题 作E花环实验时为何加入小牛血清? 不用小牛血清用人血清行吗? 加入小牛血清为什么要经56℃30分钟灭活，并用SRBC吸收?

19 淋巴细胞表面标志检测的临床意义 淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。
对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。

20 临床常见疾病中的T 淋巴细胞的变化