碱裂解法小量提取质粒 DNA

碱裂解法是较常用的质粒 DNA 提取方法。 其优点是收获率高，适于多数的菌株， 所得产物经纯化后可满足多数的 DNA 重 组操作。

实验原理 溶液 I: GTE 1.50mM 葡萄糖：增加溶液的粘稠度，使悬浮 后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。 2.25mM Tris-Cl （ pH 8.0 ） 3.10mM EDTA ：是 Ca2+ 和 Mg2+ 等二价金属 离子的螯合剂，可抑制 DNase 的活性，并抑 制微生物生长。

实验原理 溶液 II: NaOH/SDS 溶液 N NaOH ：是最佳的溶解细胞的试剂，不管 是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几 乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer （双层膜）结构向 micelle （微囊）结构 的相变化所导致。由于质粒和细菌染色体的拓扑 结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然 缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现 断裂。因此，在裂解细菌时要注意： 第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下 DNA 片断 会慢慢断裂； 第二，混合必须轻柔，不然 DNA 也会断裂。 2.1% SDS （十二烷基磺酸钠）：是一种阴离子表 面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些 蛋白质变性。

实验原理 溶液 III ：醋酸钾溶液， Ph4.8 – 当加入 pH4.8 的酸性乙酸钾降低溶液 pH 值，使溶液 pH 值 恢复较低的近中性水平时， 质粒的两条小分子单链可迅 速复性恢复双链结构，但是主染色体 DNA 则难以复性。 –SDS 遇到钾离子后变成十二烷基硫酸钾（ potassium dodecylsulfate, PDS ），而 PDS 是不溶于水的，而高浓 度的盐使得沉淀更完全。 SDS 极易和蛋白质结合，平均 两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换所产生 的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。 – 同时，尽管 SDS 并不与 DNA 分子结合，由于大肠杆菌的 基因组 DNA 很长，很容易和变性的蛋白质缠绕在一起。 在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，变性蛋白质等 缠绕一起被沉淀，而复性的质粒 DNA 以可溶性状态留在 上清夜中。

实验原理 酚 / 氯仿抽提 – 可以通过酚、氯仿抽提去除残留的蛋白质。酚和氯仿都 是蛋白质的变性剂，但酚的变性作用要远大于氯仿。 – 由于酚能溶解 10%-15% 的水，因此在使用前要用 Tris 溶 液饱和。以免减少抽提过程中 DNA 溶液的损失。 – 水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心 后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；氯仿 和酚可以互溶，加入氯仿后可以增加比重，使得酚 / 氯仿 始终在下层，方便水相的回收。 – 由于酚与水有很大的互溶性，用酚 / 氯仿抽提后会有少量 的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制 性酶切反应），用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。

实验原理 乙醇沉淀 DNA – 回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入 2 倍体积的乙醇， 在室温放置几分钟后离心就可以将质粒 DNA 沉淀出来。 – 在 pH 为 8 左右的溶液中， DNA 分子是带负电荷的，乙醇可以 消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。 Na 离 子能与这些带电基团结合，在沉淀形成的部位降低多核苷酸 链之间的排斥作用，易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀。最 常用的盐是醋酸铵／氯化锂／氯化钠／醋酸钠。 – 沉淀体系如果盐浓度高，应在室温下沉淀。放到－ 20 ℃，时 间一长反而会导致大量盐的沉淀。 – 为了去除随 DNA 沉淀的盐，可用 70% 的乙醇洗涤沉淀。

实验原理 DNA 的溶解 –DNA 沉淀经过 70% 的乙醇洗涤后，在实验台上敞 口放置一定时间，使残余乙醇挥发掉。当 DNA 沉 淀仍有些潮湿的时候，用适当缓冲液溶解便可溶得 快速而且完全。完全干燥的 DNA 沉淀溶解缓慢且 效率较低。 – 得到的质粒样品一般用含 RNase （ 20 ug/ml ）的 TE 缓冲液进行溶解，不然大量未降解的 RNA 会干 扰电泳结果的。

实验步骤 1. 取 1.5ml 过夜培养菌置于 1.5ml 离心管中，于微量 离心机上以 12000rpm 离心 1min 。 2. 弃上清液。 3. 重复步骤 1 、 2 。 4. 短暂离心后，尽量吸干上清液。 5. 沉淀中加 100μl 溶液 I ，充分悬浮沉淀（用移液体 器吹打悬浮或剧烈振荡）。 6. 加入 200μl 溶液 II( 新鲜配置 ) ，加盖后缓慢颠倒 离心管 6 次混匀（千万不要振荡），室温防置不 超过 5 min 。 7. 加入 150μl 预冷溶液 III ，缓慢颠倒 6 次混匀，置 于冰浴 15 min 。

实验步骤 8. 微量离心机上以 4 ℃， 12000rpm 离心 10min 。 9. 将上清液转移到另一新的 1.5ml 离心管中。 10. 加入等体积酚 / 氯仿（ 1 ： 1 ），震荡 1min 。 rpm, 离心 5min 。 12. 小心转移上层溶液至一新的离心管，弃去中层的 蛋白质和下层的有机相。 13. 加入等体积氯仿，震荡 1min 。 rpm, 离心 5min 。

实验步骤 14. 小心转移上层溶液至一新的离心管，加入 2 倍体积 100% 乙 醇, 混匀。 15. 室温放置 15min 。 g×10min 。 17. 去上清，用 0.5ml70% 乙醇淋洗沉淀 ( 不要把沉淀悬浮起来 ) 。 g×30 秒。 19. 尽量去上清。 20. 在室温下晾干沉淀。 21. 加入 50μlTE 缓冲液（ PH 8.0 ，含 20μg/mlRNaseA ）溶解质 粒 DNA 。 ℃温育 20min 。 ℃保存。

一、请完成实验报告。报告内容： 1 ，课件中的全部实验原理及实验步骤 2 ，实验结果：包括实验现象、结果的记录及描 述。 3 ，实验分析：对实验现象及结果（包括实验经 验、心得）的分析、归纳。 二、请预习下周实验：聚合酶链式反应（ PCR ）