植物组织培养实验 制作：杨清辉 单位：云南农业大学

一、课程性质和任务 植物组织培养主要研究如何 在无菌条件下，将离体的植 物器官、组织、细胞或原生 质体在人工配制的培养基上 培养成完整植株的过程。

二、教学内容和方法  了解植物组织培养中所涉及到的有关实验室 条件和有关仪器设备的使用。  掌握植物材料的消毒方法和无菌操作技术。  掌握通过器官培养而进行植物快速繁殖的技 术和方法。  掌握组织培养的基本操作步骤。

三、教学目的要求 通过《植物组织培养实验》的学习，使学 生能掌握植物组织培养的基本操作技术， 可独立完成植物组培的全过程，成为学生 自己的一门熟练的职业技术。同时，通过 实验培养学生观察、思考、分析问题和解 决问题的能力。

实验一 、组培室及用具的消毒与灭菌 一、目的要求 1 、通过实验，培养学生良好的卫生观念， 增强组织培养的无菌意识； 2 、掌握组培室的消毒及灭菌方法。 3 、掌握培养用具灭菌的一般操作技术。

二、仪器与用具 1 、用具 喷雾器、工作服、口罩、手套等； 2 、药品 新洁尔灭，高锰酸钾，甲醛， 75% 酒精。

三、方法步骤 （一）培养室消毒 1 、地面、墙壁消毒：用 2% 新洁尔灭喷雾。 注意事项： ①墙壁、地面喷雾要均匀，不要遗漏； ②注意安全，防止药液伤着皮肤和眼睛。

三、方法步骤 2 、甲醛熏蒸消毒  原理：甲醛与高锰酸钾混合时产生蒸汽，具有很 好的杀菌效果。  用量： 5-8m1 甲醛 + 5 g 高锰酸钾／ m 3 。  操作：关闭门窗。将甲醛置于广口容器中，加入 高锰酸钾氧化挥发。  甲醛刺激性强，熏蒸后隔 3 天才能使用。

三、方法步骤 （二）、用具的灭菌 1 、灭菌方法的选择  玻璃器皿的灭菌：湿热灭菌法或干热灭菌法；  金属器械的灭菌：干热灭菌或火焰灭菌法；  布质制品的灭菌：均用湿热灭菌法。  （注意：布质制品不能干热灭菌！）

三、方法步骤 2 、干热灭菌 将干净的器皿放在烘箱 中， 150 － 160 ℃ ， 干热灭菌 1 － 3 小时； 灭菌完毕，待冷却后 取出。

四、作业 1 、将本次实验内容整理成实验报告。 2 、简述组培实验室的灭菌过程和注意事项。

实验二、 MS 培养基母液的配制与保存 一、目的要求 1 、通过 MS 培养基母液的配制，掌握配制培 养基母液的基本技能； 2 、掌握培养基各种母液的保存方法。

二、仪器与用具 1 、仪器 天平、磁力搅拌器、冰箱； 2 、用具 烧杯、容量瓶、量筒、试剂瓶、标签； 3 、试剂 95% 酒精、 NaOH 、 HCl ，配制 MS 培养基 所需的各种无机物、有机物，蒸馏水。

三、方法步骤  母液是欲配制培养基的浓缩液，一般配成 比所需浓度高 10—100 倍。  优点： （ 1 ）保证各物质成分的称量准确性； （ 2 ）便于配制时快速移取； （ 3 ）便于低温保藏。

1 、大量元素母液（扩大 10 倍） 成分 规定量 (mg/L) 称取量 (mg/L) 母液体 积（ ml) 配 1 升培 养基用量 （ ml) KNO 3 NH 4 NO 3 MgSO 4.7H 2 O KH 2 PO CaCl 2.2H 2 O 注意： CaCl 2.2H 2 O 需要 单独保存

母液体积 配 1 升培养基用量 ＝ 扩大倍数 三、方法步骤

2 ．微量元素母液  铁盐容易形成 Fe(OH) 3 沉淀  硫酸亚铁与 Na 2 -EDTA 混合，形成络合物。  其它微量元素分别充分溶解后混合定容为一 瓶，扩大倍数为 100 倍。

2 、微量元素母液（扩大 100 倍） 成分 规定量 (mg/L) 称取量 (mg/L) 母液体积 （ ml) 配 1 升培 养基用量 （ ml) MnSO 4.4H 2 0 ZnSO 4.7H 2 O H 3 BO 3 KI Na 2 MoO 4.2H 2 O CuSO 4.5H 2 O CoCl 2.6H 2 O

3 、铁盐母液（扩大 100 倍） 成分 规定量 (mg/L) 称取量 (mg/L) 母液体 积（ ml) 配 1 升培 养基用量 （ ml) Na 2 -EDTA FeSO 4.4H 2 O

4 、有机物母液（扩大 50 倍） 成分 规定量 (mg/L) 称取量 (mg/L) 母液体 积（ ml) 配 1 升培 养基用 量（ ml) 甘氨酸 维生素 b1 维生素 b6 烟酸 肌醇

5 ．生长调节物质母液  不溶于水，需要先溶于助溶剂。  NAA 、 IAA 、 IBA 、 2,4-D 及赤霉素等，先 溶于少量 95% 酒精，再加水定容；  KT 和 BA 等，先溶于少量的 1mol/L 盐酸中， 再加水定容。

5 ．生长调节物质母液 母液浓度：用量小，使用的浓度单位是 mg/L ，因此母液一般配制成 0.1mg/ml ， 或 1mg/ml 。

6 、母液标签  注明母液名称、配制 1 升培养基时应取的 数量。 大量元素 100 ml/L

7 、母液保存  一般在 2 ～ 4 ℃的 冰箱中保存。  若发现生霉或沉 淀，就不能再使 用。

四、作业 1 、写出实验报告。 2 、配制培养基母液时应注意哪些事项？

实验三、培养基的配制与灭菌 一、实验目的 学习、掌握培养基的配制和灭菌方法。

二、仪器与用具 1 、仪器 天平、高压灭菌锅、蒸馏水器； 2 、用具 烧杯、搪瓷烧杯、量筒、试剂瓶、电炉； 3 、试剂 蔗糖、琼脂， MS 培养基母液、蒸馏水。

三、方法步骤 1 、流程图 称量蔗糖、琼脂，加水加热溶化 → 量取母液 → 加入母液，混合定容 → 调 pH 值 → 分装培 养瓶 → 封口 → 灭菌。

三、方法步骤 2 、确定配方 MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+3% 蔗糖 +0.8% 琼脂 3 、配方用量计算 大量元素（ 扩大 10 倍配 1L ） 微量元素 （扩大 100 倍配 1L ） 有机物 （扩大 50 倍配 500ml ） 铁盐 （扩大 100 倍配 1000ml ） 6-BA(1 mg/ml) NAA(0.1mg/ml) 蔗糖 琼脂 100 ml 10 ml 1.5 ml 2 ml 30 g 8 g

三、方法步骤 4 、 琼脂和蔗糖的溶化 称 8g 琼脂和 30g 的蔗糖放在搪瓷杯里，加入 约 700ml 蒸馏水，电炉上加热溶化。

三、方法步骤 5 ．母液的量取和定容 用移液管或量筒将母液依次加入烧杯中。 再与已溶解好的琼脂和蔗糖混合、定容。

三、方法步骤 6 ． pH 值的调整 A 、不同植物对酸碱度的要求不同， 多数培养基的 pH 值为 5.6 ～ 6.0 。 B 、常用 1 mol/L 的 NaOH 和 HCl 调整 pH 值。

三、方法步骤 7 ．培养基的分装  分装量：随培养容器大小而异，约 一指厚即可。  注意：不要把培养基粘到瓶口上， 以免染菌。  封口：封好瓶口，准备灭菌。

三、方法步骤 8 ．培养基的灭菌  灭菌条件 压强为 0.105MPa ，温度为 121 ℃。  灭菌时间 取决于待消毒液体容积的大小， 15-30min 。

手提式高压锅灭菌步骤 装锅加水盖锅盖通电加热 排冷空气升温保压断电降压 出锅冷却 三、方法步骤

手提式灭菌锅灭菌操作：  将培养瓶放入灭菌锅，盖好锅盖。  压力上升到 0.05 MPa 时（ 111 ℃） ，打开 “ 放气阀 ” 将冷空气排尽，关闭 “ 放气阀 ” 。  压力达到 MPa 时（ 121 ℃） ，维持足 够时间，关闭电源。  待压力回复到 “0” 时才可以开启灭菌锅。 三、方法步骤

实验四、外植体的消毒与接种 一、目的要求 通过在超净工作台上进行无菌操作训练， 使学生初步掌握组织培养的无菌操作技 术。

二、材料与用具 1 、材料 烟草幼叶或其它培养材料。 2 、仪器与用具 超净工作台、镊子、剪子、酒精灯等。 3 、试剂 75% 酒精， 0.1% 升汞、无菌水等。

三、方法步骤 1 、接种室提前用紫外灯照射 30 分钟以上。 2 、提前 20 分钟开启超净工作台。 3 、用酒精棉球擦拭双手，然后用 70% 酒精喷 雾降尘，并擦拭工作台面。 4 、将接种工具浸泡在 75% 酒精里，然后在酒 精灯火焰上灼烧，放置冷却。

外植体的消毒和接种

三、方法步骤 5 、外植体消毒 （ 1 ）水洗，滤纸吸干； （ 2 ） 75% 酒精中浸泡 5-10 秒； （ 3 ）在 0.1% 升汞中浸泡 5-10 分钟； （ 4 ）无菌水漂洗 3-5 次。

三、方法步骤 6 、接种：将培养材料放到培养基上。 （ 1 ）用已灭菌的镊子将外植体转接到培养瓶 中，轻轻插入或放在培养基表面。 （ 2 ）接种完毕后，将瓶口在火焰上转动灼烧， 封口。

四、作业 1 、将本次实验内容写成实验报告。 2 、接种一周后，观察接种材料是否污染， 如果污染，试分析污染的原因。

实验五、菊花的茎尖培养 一、目的要求 1 、学习和掌握菊花外植体表面消毒技术 2 、熟练掌握菊花茎尖切割及培养的操作基 本技术。

二、材料与用具 1 、材料 菊花嫩茎； 2 、仪器与用具 超净工作台、解剖镜、接种器械、酒精灯等； 3 、试剂 MS 培养基、 0.1% 升汞。

三、方法步骤 1 、剥取茎尖 切取顶芽或腋芽 3-5cm ，去除叶片。 2 、材料消毒 在超净工作台上，用 0.1% 升汞溶液对茎 尖消毒 5-10 分钟，无菌水漂洗 3-5 次，放到 无菌的吸水纸吸干水分。

三、方法步骤 3 、茎尖剥离 在解剖镜下，将材料置无菌的 盘子内，剥去端部的嫩苞叶， 露出锥形体，切取带 2-3 个叶 原基，长度为 0.3mm 和 0.5mm 两个不同长度的茎尖。

微茎尖

三、方法步骤 4 、接种 将茎尖迅速接种到培养基上，防止茎尖脱 水。接种时注意茎尖向上，不能倒置。

接种示意图

四、作业 1 、调查外植体表面消毒接种成功率。 2 、分析接种不成功的原因。 3 、调查 0.3mm 和 0.5mm 两个不同长度的茎 尖接种成功率。