“ 癌症的基因诊断和反义核酸基因治疗治疗 ” 专题汇报

一、一般情况介绍 时间： 9 月 11 日 —— 9 月 17 日 地点：福建省血液病研究所 福建医科大学附属协和医院血液内科 学员来源：黑龙江 云南 江西 湖南 广东 南宁 福建 讲授方式 CAI 博导 + 博士 + 技术员 内容：理论和实验部分 理论部分： 13 个专题（讲座） 实验部分： 8 项内容（示范）

福建医科大学内科博士点 福建省 “211 工程 ” 重点学科 福建省科委的优先发展研究所 福建省教委和福建省卫生厅的重点学科 国家药品监督管理局的临床药理基地 专业技术人员 67 人，教授 6 人，副高 10 人 国家级专家博导 3 人 硕导 9 人 62 项科研成果（国际、国家、省部及省厅级） 培养博士 22 人 硕士 45 人 研究方向 癌症的基因诊断和基因治疗 细胞因子与造血调控 造血细胞培养与造血干细胞移植 福建省血液病研究所简介

1 、反义核酸基因治疗癌症研究现状与展望 2 、基因转移在肿瘤治疗中的应用 3 、反义技术在体外净化中的应用 4 、癌症 Bcl-2 基因 5 、癌症的 c-myc 基因 诊断及反义核酸基因治疗 6 、癌症 MDR1 基因 7 、慢粒白血病 bcr-abl 融合基因的检测及基因治疗 8 、寡脱氧核苷酸的合成及纯化 9 、癌症基因缺损的测序诊断 10 、核酶在癌症基因治疗中的应用 11 、肽核酸在癌症治疗应用中进展 12 、白血病细胞因子自分泌及其意义 13 、裸鼠、 Scid 鼠肿瘤模型的建立及其应用 内容 理论

1 、免疫组化 2 、癌基因荧光定量 PCR 3 、癌细胞系的培养与保存技术 4 、 FCM 5 、癌症基因缺损的测序诊断技术 6 、基因药物反义核酸的纯化 7 、动物模型的建立及 反义核酸治疗癌症动物实验技术 考试 1.5 小时 实验部分

现代科学证明 人类所有的疾病都与基因变异或受损有关 人类现有的 种疾病 第一类单基因病 如 血友病、多指病 第二类多基因病 如癌症、糖尿病、 高血压、冠心病、哮喘病等 第三类获得性基因病 如病毒性肝炎 二、反义核酸基因治疗癌症研究现状与展望

基因 : 具有遗传效应的 DNA 片断 人类总基因 15.3 万个 3.8 万已肯定 11.5 万个可能 长度 为地球 太阳来回 6 次 基因组或称词典 20bp/second 需 11 年读完

DNA 由碱基互补的两条单链组成， 模板链称正义链 互补单链称反义链 反义核酸 人工合成一段与靶基因 mRNA 以 碱基互补结合，从而阻断其表达 的寡核苷酸序列 包括：反义 DNA 反义 RNA 核酶 Antisense Oligodeoxynucleotides AS-ODN

反义核酸作为基因治疗药物必须具备的条件 1 、能进入靶细胞内，并有一定浓度 2 、细胞内长半衰期 3 、对抗细胞内、血浆和体液的核酶的降解 4 、特异性识别靶细胞并稳定结合 5 、能人工合成 6 、使用安全有效

注意 1 、 AS-OND 长度的优化选择 16-20bp 最佳 2 、 AS-ODN 进入靶细胞内的机制 蛋白受体介导的胞吞作用 AS-ODN 带负电荷 3 、 AS-ODN 的修饰和细胞内稳定性 甲基磷酸酯 硫代磷酸酯 肽核酸

HOPOHOPO O HHHH 碱基 H CH 2 H O O HHHH 碱基 H CH 2 H HOPOHOPO X-X-=O

1 、新的化学物质 —— 寡核苷酸 2 、新的药物受体 —— mRNA 3 、新的受体结合方式 —— 碱基互补杂交 4 、新的药物受体结合反应 —— Rnase H 介导的靶 mRNA 的降解 反义药物与传统药物的不同 特异性强 准确性高 应用前景广阔 组织分布 除脑以外的所有组织 主要为肾肝脾及骨髓

AS-PS-ODN Bcl-2 mRNA 抑制细胞凋亡 c-myc mRNA 细胞增殖和分化 c-myb mRNA (p75) 造血细胞增殖和分化 MDR1 mRNA (p170) 多药耐药 Bcr-abl mRNA (p210) 抗凋亡

反义核酸对肿瘤细胞株的作用 细胞株 : HL-60 K562 U937 原代白血病细胞株 : AML ALL APL CML 等 反义核酸作用的靶基因 : Bcl-2 c-myc c-fos c-syc MDR bcr-abl p53

反义药物对实体瘤动物模型的药效学研究 动物模型 MMP-2 PKC-a c-myc PKAI 端粒酶 RNA C-raf-1 PKA bcl-2 人结肠癌 人膀胱癌 人黑色素瘤 人肾癌 人恶胶质瘤 人肺癌 人结肠癌 肝细胞癌 效果 预防肝转移 抗癌效果呈序列特 异性和浓度依赖性 显著抑制肿瘤生长, 延长生存期 肿瘤生长抑制率为 50% 肿瘤缩小 50% 肿瘤生长呈剂量 依赖性降低 肿瘤生长呈剂量 依赖性抑制 抑制肝细胞癌生长 癌细胞类型 靶基因

反义药物治疗实体瘤的临床研究 ISIS5132 C-raf 各种实体瘤、淋巴瘤 临床 II 期 部分病例延长疾病稳定期 7-10 个月 ISIS3521 PKC-a 各种实体瘤, 包括卵巢癌、 前列腺癌、结肠癌、脑瘤 临床 II 期 部分有效 ISIS2503 Ha-ras 间皮瘤、结肠癌、 胰腺癌等 临床 I 期 部分病例延长疾病稳定期

Bcl-2 c-myc c-myb MDR1 Bcr-abl 的表达、检测和 反义核酸治疗的应用范围 略

核酶在癌症基因治疗中的应用 核酶是指一类具有催化活性的 RNA 分子 可特异性地与靶 RNA 分子配对， 对底物进行切割，促进 RNA 的降解 从而使其失去生物学功能 分六类： 第一型内含子 第二型内含子 Rnase P 发夹式核酶 斧头式核酶 锤头式核酶

NNNNNNNNNUXNNNNNNNN NNNNNNNNNA CNNNNNNN A C A U G A G C GG A N N N N N N N 催化部分 N N 前臂 后臂 N: A/C/G/U X: C/U/A 切割点

1 、 Kobayashi 等 MDR1 基因转录物核酶 导入 MOLT3/TMQ800 细胞系, 对长春新碱的敏感性提了 35 倍 3 、将 bcr/abl 接合区序列的锤头型核酶 的 cDNA 插入逆转录病毒载体, 导入 K562 细胞, 抑制生长, 诱导凋亡 2 、 Kashani 等对 H-ras 的核酶导入 人膀胱癌细胞株 EJ 细胞 体外生长受抑制, 体内致癌性及侵袭力明显下降

肽核酸在癌症治疗中的应用 反义治疗 反基因策略：通过寡核苷酸 与双链 DNA 结合形成局部 的三链结构来抑制基因的转录 肽核酸 基因原位修复

O B O O P =O O O B O O P =O O DNA B NH N B O = O = O = N = PNA

三、基因转移在肿瘤治疗中的应用 精确定位： 两方面 (AFP CEA) 有效性： 安全性： 基因表达量和持续时间的控制： 1 、转移基因的要求

2 、基因转移的载体 ⑴逆转录病毒载体 ⑵腺病毒载体 ⑶腺病毒相关载体 ⑷物理转移（脂质体、裸 DNA 、生物枪）

逆转录病毒载体只能感染分裂细胞 腺病毒载体不能将基因整合到细胞染 色体上 腺相关病毒载体则避免了上述缺点

⑴肿瘤基因的修饰 A 肿瘤基因的修正 修复一个或多个缺陷基因 B 前体药物代谢酶 TK/GCV 系统毒性作用和旁观效应 C 肿瘤疫苗 3 、肿瘤基因治疗的策略

未成熟树 突状细胞 提呈 成熟树 突状细胞 第二信号 肿瘤 细胞 消化处理 抗原 + MHC 1, 肽复合物 共刺激分子 基因转移特异抗原或佐剂基因 肿瘤 细胞 分泌细胞因子 杀伤 T 淋巴细胞毒细胞

⑵宿主免疫系统基因的修饰 T 细胞修饰 白血病患者 移植物抗宿主 反应（ + ） 异基因移植物 白血病复发低 白血病患者 （同 卵双生或 去除 T 细胞的病人） 白血病复发率高 移植物抗白血病作用（ GVL ）

B- 细胞 + EBV CTL 被杀灭 免疫缺陷 前 B 细胞逃脱 CTL 攻击 淋巴瘤 EBV 免疫供者 取外周血 CTL GVL

⑶改变宿主对细胞毒药物的耐药性 用逆转录病毒转移 MDR1 基因 到小鼠祖细胞 已证实能减少化疗引起的骨髓移植

1 、反义药物因有 6 个条件， 具有广阔的应用前景 2 、肿瘤细胞的死亡应包括坏死 和凋亡两个方面 3 、 bcl-2 c-myc bcr-abl MDR1 基因 并非特异, 加之调节多层次 网络化, 其治疗效果有其局 限性 小结

5 、展望 肽核酸与 DNA 形成三链结构 4 、反义核酸治疗与自杀基因治疗 两系统的比较 基因原位修复 核酶对 RNA 的特异切割作用 传统药物针对蛋白质的功能 反义核酸与靶 RNA 结合

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