第7章 酵母基因工程

五、酵母菌的表达系统 三、酵母菌的载体系统 二、酵母菌的宿主系统 一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 六、利用重组酵母生产乙肝疫苗 四、酵母菌的转化系统

一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 （1）酵母菌的分类学特征 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母 菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统。

（2）酵母菌表达外源基因的优势 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） 酵母菌是最简单的真核模式生物

二、酵母菌的宿主系统 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌

广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 酵母属 如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母 表达外源基因最理想。

提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型 ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的ATP酶 生物效应 作用位点 ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的ATP酶 ssc2 提高重组蛋白表达 转录后加工 rgr1 提高重组蛋白表达 转录水平 ose1 提高重组蛋白表达 转录水平 ssc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶Y rho- 提高重组蛋白表达 转录水平

抑制超糖基化作用的突变宿主菌 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团， 它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖 链两部分组成。 能抑制超糖基化的突变类型 酵母菌普遍拥有蛋白 质的糖基化系统，但野生 突变类型 生物效应 型酿酒酵母对异源蛋白的 mnn 甘露糖生物合成缺陷型 糖基化反应很难控制，呈 alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型 超糖基化倾向，因此超糖 och 外侧糖链添加缺陷型 基化缺陷株非常重要。

减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 （1）泛素介导的蛋白质降解作用 靶蛋白 Ubiquitin 76 aa Lys HOOC ubiquitin ligase E3 靶蛋白 Lys ubiquitin ligase E3 靶蛋白 Lys 蛋白酶体

（2）酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因 酵母菌共有四个泛素编码基因： UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达 酵母菌共有七个泛素连接酶基因： UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7

（3）泛素降解途径衰减的酿酒酵母 UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， 因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体 UBA 1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位 基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解 Ubc4 - ubc5 双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效

三、酵母菌的载体系统 酵母菌中的野生型质粒 酵母菌克隆表达质粒的构建

酵母菌中的野生型质粒 （1）酿酒酵母中的2m环状质粒 几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链 环状质粒，拷贝数达50至100个。 A REP1 FLP 几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链 IR 环状质粒，拷贝数达50至100个。 RAF A IRs 反向重复序列，600 bp，重组 ori IR FLP 编码产物驱动IRs的同源重组 STB REP2 REP 编码产物控制质粒的稳定性 同源重组 STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及 B 克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质 粒类似。

（2）乳酸克鲁维酵母中的线状质粒 乳酸克鲁维酵母中含有两种不同 的双链线状质粒pGKL1和pGKL1 拷贝数为50-100个，分别携带K1 DNA聚合酶 毒素蛋白ab 免疫蛋白 g 亚基 的双链线状质粒pGKL1和pGKL1 拷贝数为50-100个，分别携带K1 反向重复序列 pGKL1 8.9 kb K2两种能使多种酵母菌致死的毒 素蛋白编码基因（a b g），同时含有毒素蛋白抗性基因。

酵母菌克隆表达质粒的构建 （1）含有ARS的YRp质粒的构建 ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb 记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。 以ARS为复制子的质粒称为YRp 以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代 后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。

（2）含有CEN的YCp质粒的构建 含有TEL的YAC质粒的构建 CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列 将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1 - 5个 含有TEL的YAC质粒的构建

（3）含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建 构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定 序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域

四、酵母菌的转化系统 酵母菌的转化程序 转化质粒在酵母细胞中的命运 用于转化子筛选的标记基因

酵母菌的转化程序 （1）酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化 法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%。 但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约 原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%

（2）碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克 处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性： 吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 共转化现象极为罕见

（3）酵母菌电击转化法 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA， 但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负 作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件 适用范围广，而且转化率可高达105 / mg DNA。

转化质粒在酵母细胞中的命运 单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍 含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制 不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体 这对于体内定点突变酵母基因组极为有利 克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体 DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总 数的50-80%

用于转化子筛选的标记基因 （1）营养缺陷型的互补基因 用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因和 显性基因两大类 营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如： LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难

（2）显性标记基因 显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白 aph 氨基糖苷转移酶 抗G418 cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素 遗传表型 aph 氨基糖苷转移酶 抗G418 cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素 dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 铜离子螯合物 耐受铜离子 suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖 ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂

五、酵母菌的表达系统 外源基因在酵母菌中表达的限制因素 酵母菌启动子的可控性 酵母菌表达系统的选择

酵母菌启动子的可控性 （1）温度控制型启动子 pho4TS-PHO5启动子： 酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开 PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35℃时失活 因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35℃时关闭 23℃诱导表达

a – a 型启动子： 受体细胞基因组 重组质粒 酿酒酵母有a和a两种单倍体，分别由MATa和MATa两个等位基因决定。 受体细胞基因组 重组质粒 a – a 型启动子： 酿酒酵母有a和a两种单倍体，分别由MATa和MATa两个等位基因决定。 a1因子决定a细胞特征表达a2因子阻遏a细胞特征表达a1-a2阻遏a细胞特征表达 编码a2因子的基因突变型hmla2-102能产生a2变体，它能灭活a1，同时阻遏a型 25℃ Sir3-8TS a1 a 型启动子 hmla2-102 MATa a 型启动子 35℃ Sir3-8TS a2 a1 a 型启动子 hmla2-102 MATa a 型启动子 a1

（2）超诱导型启动子 半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达 酿酒酵母 的半乳糖 利用酶系 由GAL1 GAL7和 UAS GAL1 GAL7 GAL10 GAL7和 半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达 GAL10 基因编码 GAL10 Promoter GAL80 GAL4 UAS GAL1 GAL7 GAL10

外源基因在酵母菌中表达的限制因素 外源基因稳态mRNA的浓度 外源基因mRNA的翻译活性 酵母菌对密码子的偏爱性 在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96% 以上的氨基酸是由25个密码子编码的

酵母菌表达系统的选择 （1）酿酒酵母表达系统 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油 醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢 酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得 有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能 大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。

（2）乳酸克鲁维酵母表达系统 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源 蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也 能稳定遗传40代以上。 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优 于酿酒酵母表达系统。

（3）巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生 长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长 迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯 德毕赤酵母表达系统的三大优势。 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因 的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种 具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。

（4）多型汉逊酵母表达系统 多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被 克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载 体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。 目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获 得成功表达。

六、利用重组酵母生产乙肝疫苗 由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重 中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒 还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒 感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其 广泛应用提供了可靠的保证。

乙型肝炎病毒的结构与性质 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母

乙型肝炎病毒的结构与性质 （1）乙型肝炎病毒的结构 乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具有感染力的病毒 颗粒呈球面状，直径为42 nm，基因组仅为3.2 kb。病毒颗粒的主要 结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化 和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（ HBcAg ）、 病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。 除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的22 nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的 1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。

（2）乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因 108 aa 55 aa 226 aa preS1 preS2 S 226 aa S 多肽 ATG ATG ATG TAA preS1 preS2 S 226 aa S 多肽 281 aa M 多肽 399 aa L 多肽

（3）传统乙肝疫苗的制备 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫 苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的 疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。

产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括 将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活 性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平 均颗粒直径为 22 nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中 的病毒颗粒相同。 目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化 重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。 进一步的研究表明，M多肽和L多肽对S型疫苗具有显著的增效作 用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对 S抗 原缺乏响应的人群的免疫反应。

产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 （1）整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建 转化his-的受体细胞 重组分子 染色体DNA his+的转化子 Bgl II PARS2 Bgl II Bgl II 5’ AOX1 3’ AOX1 转化his-的受体细胞 pBSAG151 HBsAg 11 kb 重组分子 PHIS4 染色体DNA his+的转化子 5’ AOX1 HBsAg PHIS4 3’ AOX1

（2）重组巴斯德毕赤酵母的性能 由于巴斯德毕赤酵母染色体DNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因 AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。 重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲 醇诱导HBsAg表达，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3% 在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐 中培养，最终可获得90克22nm的HBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝 疫苗。