聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用.

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聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用

聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K. Mullis建立,并和定点突变的发明者M 聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立,并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖,为生命科学领域的研究开创了崭新时代。

PCR反应的特点 特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高 指数增长,从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平 简便、快速 2~4 小时完成扩增 对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板

一、PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤: 变性(denaturation):94 C ~95 C 退火(annealing):40 C ~70 C 延伸(extension):72 C 3个步骤作为PCR的一个循环,每当完成一个循环,一个分子的模板被复制为二个,产物量以指数形式增长。

PCR原理 添加反应混合液 及样本 加入试管中 变性 退火 引物 耐热DNA聚合酶 d.NTPs 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ d.NTPs 5’ 3’ 引物 添加反应混合液 及样本 5’ 3’ 5’ 3’ 耐热DNA聚合酶 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 加入试管中 5’ 3’ Most researchers are well versed in the performance of PCR. However, I usually emphasize that the performance of Real-Time PCR requires an emphasis on each step. STEPS 1) Prepare the Master Mixture and add all components to the reaction tube. 2) Denature the Template to generate single-stranded DNA. Usually performed at 95 oC for 30 to 60 s. 3) Annealing temperature. The temperature is lowered in order to promote the binding of the primers to its complimentary target. Generally ranges between 50 and 65 oC. 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 变性 5’ 3’ 5’ 3’ 退火

PCR原理 延伸 继续延伸 循环 Taq Taq Taq Taq 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 延伸 Taq 5’ 3’ 5’ 5’ Taq 5’ 3’ 继续延伸 Taq Starts with a Picture of the Annealed Template. 4) Extension Step - Between 65 and 72 oC. In many cases, this step is linked to the annealing temperature. When done this way, it is considered a 2 step PCR. Lead into next slide It is repeated to generate an exponential growth. 5’ 3’ 5’ 5’ Taq 3’ 循环

PCR原理 第二个循环 4个拷贝 第三个循环 8个拷贝 第n个循环 2n个拷贝 5’ 3’ 第二个循环 4个拷贝 5’ 3’ 第三个循环 8个拷贝 This demonstrates the power of exponential growth. Start with 2 copies, then 4 copies, then 8 copies, etc. 第n个循环 2n个拷贝

18 The Polymerase Chain Reaction (PCR) 20-30X Melt Anneal Extend 94 C (30-60 s/kb) Melt Anneal Extend 20-30X 18

NIH Cycle #2 20-30X Melt Anneal Extend 40-60 C (30 s) 72 C (30-60 s/kb) 94 C (30 s) Melt Anneal Extend 20-30X NIH

PCR演示文件

二、PCR的反应体系和反应条件 (一)PCR反应体系 参与PCR反应的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和 缓冲液等。

1 模板 包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等 模板DNA需较高的浓度 RNA作为模板时,须先将RNA逆转录为cDNA,再以 模板量:1000ng、500ng、100ng、50ng

2、引 物(Primers) 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度,是化学合成的寡核苷酸片段 化学合成的寡核苷酸 能与模板特异地结合 引物决定产物的特异性和长度 引物设计时必须遵循一些原则

引物浓度:0.1 ~ 0.2umol/L,浓度过高容易生成引物二聚体 设计引物的原则: 二条引物分别位于被扩增片段的两端,与模板正负链序列互补 长度为18 ~ 25个核苷酸 二条引物之间避免形成引物二聚体 引物的碱基组成应平衡 引物退火温度计算:Tm=2(A+T)+(C+G) 引物的5`端可被修饰(引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记) 引物浓度:0.1 ~ 0.2umol/L,浓度过高容易生成引物二聚体

3、脱氧核苷三磷酸(dNTP) 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧 核苷三磷酸的混合物 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 浓度过高虽能加快反应速度,但非特异 性扩增也随之增加 dNTP浓度:20 ~ 200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增

4、DNA聚合酶 从一种生活在热泉(80℃~90℃)中的水栖 噬热菌(Thermus aquaticus, Taq)中提取, 有很高的耐热稳定性 Taq 酶的作用: 模板指导下,以dNTP为原料,在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸,形成3’, 5’ -磷酸二酯键,使DNA链沿5’→3’方向延伸,催化DNA合成。 最适酶量:1-2.5U (酶量过多,导致非特异性扩增)

Taq DNA聚合酶复制的保真性: Taq DNA聚合酶无3’ → 5’外切酶活性,因而无校正功能,在复制新链的过程中会发生碱基错配。 Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000,碱基替换率为1/8000,故扩增的片段越长,错配的机率越高。

耐热的 DNA多聚酶: Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性,较高的保真性,降低碱基错配率2 ~ 10倍。

5、镁离子浓度 镁离子浓度是一个至为关键的因素,对于反应 系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响 虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关, 但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及 鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离 Mg2+的浓度从而影响酶的活性。 当dNTP浓度为200umol/L时,MgCl2的浓度为1.5mmol/L较宜。

6、其它反应因素 pH:调节至酶反应所需的最适pH( pH =7.2左右) 盐:合适的盐浓度有利于稳定杂交体,有利于引物与模板杂交 基质:BSA、gelatin 、Tween20、DTT等(牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶的活性)

(二)PCR的反应条件 反应温度(变性、退火、延伸) 反应时间(变性、退火、延伸) 循环次数(PCR效率及产物量)

1、温度 变性温度:94 ~ 97 ℃ 退火温度:低于引物Tm 5 ℃左右 温度过高:降低扩增效率; 温度过低:增加非特异性扩增 延伸温度:72度,此时Taq酶具有较高的酶 促活性

2、时间 第一次变性应给予足够时间(5 ~ 7分钟) 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度,一般为30秒~ 1分钟,时间过长易导致非特异性扩增

3、循环次数 重复次数一般设为25~35个循环 扩增反应的平台效应: 理论上,PCR反应产物呈指数性增长,但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止,达到反应平台,此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长

PCR过程的实时监测 指数增长期 线形增长期 平台期 理论值 实际值 Log 产物DNA 循环数 # The Theory of the amplification kinetics is much different then what is actually observed. Picture explains the actual kinetics of the PCR process. Remember, PCR is an enzymatic process and is therefore affected by the same factors that effect ANY Enzymatic process. 循环数 #

平台出现得迟早与模板的初始量有关,模板初始量越多,平台出现得越早。 平台效应产生的因素: 引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等

三、PCR技术的质量控制 (一)实验室的规范化设置 实验室的规范化设置: 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 基因扩增检验的全过程的质量保证 室内质量控制和室间质量评价 PCR实验系统中的污染源及防污染措施

防污染体系: 正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施、反应体系中以dUTP取代dTTP,再加入尿嘧啶糖苷酶(UNG)即可破坏以往的扩增产物、人员培训、试剂质量

(二)PCR技术的质量保证 分析前因素:标本采集、运送、稳定化处理、贮存 分析中因素:核酸提取、逆转录、扩增反应、设置 对照系统(包括阴性对照、阳性对照、内对照等) 分析后因素:报告形式、反馈的信息等

PCR操作中的若干问题 与解决策略

一、试剂贮存 1、裂解液 4℃贮存,避免反复冻融,否则影响裂解效果,造成假阴性。 2、反应液 -20℃贮存。试剂开封后,4℃保存在1-2周内用完。反应液反复冻融5次影响不大,但过多的冻融会降低扩增效率。

3、Taq酶 -20℃贮存(存于有霜冰箱)。 4、阳性模板 -20℃贮存,可反复冻融5次左右。阳性模板4℃也可贮存2周左右。

二、标本处理 1、尿道、阴道、宫颈分泌物 棉拭子经生理盐水洗涤后,2000r/min后取上清500ul。过多的沉淀物裂解后,会导致PCR抑制而产生假阴性结果,或出现电泳背景模糊和拖尾现象。尤其是脓性分泌物,沉淀物过多,易造成假阴性。

2、尿液 男性尿道炎患者,若无分泌物,可用初段尿。尿液置冷冻保存,但解冻后需37℃保温,以使尿盐充分溶解,过多的盐沉积物会抑制PCR。

3、血清 乙型肝炎病毒,血清可置4℃贮存几天,-20℃贮存三个月以上不影响检测结果,经多次冻融也不影响检测结果。 HCV等,血清必须置-20℃贮存,一般冻融3次以上便会影响检测结果,导致假阴性。

4、全血 尽快处理(一般不超过24h),因其白细胞随时间的延长而减少。处理时尽量将红细胞去除干净。红细胞末去除干净,将干扰PCR,导致扩增效率下降。

5、痰液 先用1N NaOH液化,37℃~50℃可缩短液化时间,长时间的液化(过夜或数天)不影响TB的检测。 痰液消化后,均要用蒸馏水洗涤离心沉淀物1-2次,否则,沉淀物过碱而抑制PCR。

6、胸水、脑脊液 胸水、脑脊液标本离心所得沉淀物极少,加裂解液的量也要相应减少。为保证裂解充分,可在管内滴入1-2滴石蜡油后再裂解。 6、胸水、脑脊液 胸水、脑脊液标本离心所得沉淀物极少,加裂解液的量也要相应减少。为保证裂解充分,可在管内滴入1-2滴石蜡油后再裂解。

三、标本保存 送检标本不能及时处理,除全血外,均可置-20℃保存数天。 处理好的标本可置-20℃保存。检测时,需将解冻后的标本充分振荡,然后经100℃水浴5min,离心后取上清液检测。

四、常见问题与解决策略 1、扩增失败的原因 (1)试剂错加或漏加 实验中发现阳性对照扩增失败,可用原试剂重复一次,以确定试剂是否错加或漏加。 (2)试剂失效

若以上方法仍不出阳性结果,可新启封一套试剂,有阳性标本,可用此标本与阳性模板同时再检一次加以确认。试剂中,阳性模板失效较常见,仅阳性模板失效,更换模板或用阳性标本代替即可。当怀疑试剂有质量问题时,用保存的阳性标本作为阳性对照检测一次,即可得到明确结论。(阳性标本保存时间不宜过长,一般不要超过3周,并经常更换。)

(3)扩增仪温度偏差 扩增仪温度的偏差是PCR失败最常见因素。退火、延伸,上下偏差2℃通常不影响实验结果。但变性高于96℃或低于92℃,对某些检测带来不良结果,甚至导致实验失败。

2、拖尾现象

因素 (1)裂解所用沉淀物过多 标本裂解后未经充分离心,上清较混浊。 组织标本虽经规范化处理,会有拖尾产生,标本是否新鲜相关 (2)裂解液、反应液变质 标本中DNA含量过高或杂质过多。降低加样量拖尾可明显改善 (3)Taq酶加量过大或扩增循环数太多

3、非特异条带

因素 (1)试剂因素(引物特异性不佳, Taq酶质量问题) (2)个别标本引起,无法避免 (3)酶量过大,循环次数太多 (4)裂解时沉淀物太多

4、引物二聚体

(1)试剂因素 PCR试剂均会或多或少产生一些引物二聚体。 二聚体形成的原因:引物之间的互补和瞬时错配。引物二聚体过强,则会降低PCR效率,导致检测敏感性下降。

(2)操作不当 当一个反应体系建立后,在室温放置时间过长,会引起扩增后的二聚体加重。因此,PCR操作时,一旦管内所有试剂均加好后,应立即上机扩增。一旦由于某种原因不能扩增,则将反应管置4℃暂存。

5、假阳性 污染引起 污染不一定导致所有标本均出阳性结果,有些标本中存在一定的抑制剂,虽受轻微污染但不足以出阳性结果。但会引起阴性对照出现阳性结果。由污染引起的阳性条带一般较弱,标本出现的条带强度基本一致或差异不明显。

6、非特异引起

某一病原体通常不出现非特异带,但个别标本偶有一条与阳性对照不一致的带且强度也较好,则多半为阳性,是由野生突变株引起。 有时可看到某一标本可出现2-3条带,若与阳性对照位置在同一水平上的带最强,其余带则较弱,则仍可判阳性结果,否则应判阴性。

二温法扩增可有效降低非特异扩增。对有非特异条带的标本,必要时可用94℃变性30秒、64℃ 延伸60秒,35次循环的条件,再检一次,往往可以得到满意结果。

7、假阴性 (1)试剂失效 当阳性对照出阴性结果,并用以往保存的阳性标本也不出阳性结果时,排除了仪器因素,便可认定试剂中反应液或Taq酶失效。

(2)裂解液失效 裂解液室温放置过久或多次反复冻融,导致裂解液效果明显下降,引起阳性率下降和假阴性的常见原因。 由于反应体系正常,仅裂解液失效,因此,阳性对照不受影响。

(3)试剂贮存过久 试剂贮存过久(接近或超过有效期,其间已反复冻融数次),导致检测敏感性下降,而出现假阴性。 (4)标本处理不当(见标本处理)

(5)变性温度偏低 不同病原体DNA由于所含G、C碱基对的百分比不同,Tm也不一样。有些DNA所含G、C碱基对丰富,当变性温度低于92℃时,双链DNA不能完全解链,扩增往往失败,产生假阴性结果。

6、紫外灯 有些紫外灯波长不对(发红光或兰色可见光太强)、紫外灯管老化,从而引起激发光较弱,导致一些本可见的弱阳性条带漏检造成假阴性。 6、紫外灯 有些紫外灯波长不对(发红光或兰色可见光太强)、紫外灯管老化,从而引起激发光较弱,导致一些本可见的弱阳性条带漏检造成假阴性。

五、阳性率 PCR试剂的阳性率是操作人员最为关心的问题。有意思的是某一批号试剂甲地使用良好,阳性率正常,而在乙地则阳性率较低,甚至连阳性对照也不出结果。据我们调查引起阳性率变化的原因是多方面的,其中有些原因也难以解释。

1、运输 有些地区由于交通不便,运输途中耽搁太久,尤其是盛夏,途中时间超过4天,可能会影响试剂的敏感性。 2、贮存与使用 试剂应置-20℃贮存。有些实验室冰箱冷冻室所存物品太多,且每天开启频繁,冰箱实际温度太高,从而导致试剂质量下降。裂解液多次冻融导致裂解效果下降也是引起阳性率下降的主要原因。

3、扩增仪温度 不同的扩增仪本身温度的波动对阳性检出率影响很大,经常跟踪和校正仪器的温度(尤其是变性温度)是确保正常阳性率的关键因素之一。 3、扩增仪温度 不同的扩增仪本身温度的波动对阳性检出率影响很大,经常跟踪和校正仪器的温度(尤其是变性温度)是确保正常阳性率的关键因素之一。

4、试剂因素 PCR试剂由Taq酶、引物、dNTP、缓冲液、裂解液等构成。同一厂家不同批号的酶质量也有所不同,引物、dNTP、裂解液等也有类似问题。因此要确保每批试剂均有同一的质量,是比较困难的。

5、管子的选择 不同的厂家生产的管子由于管径、管壁的差异,以及管子的清洗情况不同,而影响检测效果。 国产管子使用前,最好用蒸馏水浸泡煮沸10~20分钟,沥干水份烘干后再用。

第二节 以PCR为基础的相关技术

以PCR为基础的相关技术 逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 定量PCR (quantitative PCR ) 多重PCR (multiplex PCR) 免疫PCR 差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR) PCR诱导定点突变 原位PCR (in situ PCR)

一、逆转录PCR(RT-PCR) 以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。 主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针,检测RNA病毒、分析基因表达等

逆转录生成cDNA方式: 以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物 以oligo(dT)作为引物, mRNA3`末端polyA尾与之互补 以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物,进行扩增

二、定量PCR 对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析。 主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等 在定量PCR反应体系中,除了常规PCR反应所需的材料和试剂外,还必须引入内参照系统。 内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是-肌球蛋白基因

相对定量PCR 设计相对定量PCR实验方案时须注意: 预先确定最佳模板量和PCR循环数,使所 采用的各反应参数在扩增指数范围内,避 理论值 实际值 Log 产物DNA 相对定量PCR 设计相对定量PCR实验方案时须注意: 预先确定最佳模板量和PCR循环数,使所 采用的各反应参数在扩增指数范围内,避 免平台效应。 “管家基因”与靶基因同管扩增,扩增产物 的长度应有所不同,以保证电泳能将两者 分离开。

绝对定量 PCR 实时定量 PCR 外参照系统的设置 内参照系统的设置 对核酸扩增反应进行直接和动态的监测, 实现对靶基因的实时定量分析 Self explanatory

荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR),又称实时PCR,是目前较精确的进行定量检测PCR的方法

Reverse transcription followed by Polymerase Chain Reaction Considered to be the most sensitive method for the detection and quantification of gene expression levels. Used as a follow-up when a particular gene is suggested in micro-array studies. Potential problems with sensitivity, specificity and reproducibility.

荧光信号的检测方法: 1、DNA结合染料技术 2、水解探针技术(TaqMan probe)技术 3、杂交探针技术

TaqManTM Add Master Mix and Sample Reaction Tube Denaturation 5’ 3’ 5’ 3’ d.NTPs Primers Add Master Mix and Sample Thermal Stable DNA Polymerase 5’ 3’ R Q Probe Reaction Tube 5’ 3’ Taq 5’ 3’ Denaturation 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ l 5’ 3’ R Q Annealing

TaqManTM Extension Step 1. Strand Displacement 2. Cleavage 5’ 3’ R Q 5’ 3’ 5’ 3’ Extension Step R Taq 3’ Q R 1. Strand Displacement 5’ 5’ 3’ R Taq 3’ Q 2. Cleavage 5’ 5’ 3’ Taq R Q 3. Polymerization Complete 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ Q Taq R l 4. Detection

实时定量RT-PCR检测CEA基因拷贝数在监测胃肠癌微转移中的应用

CEA 基因在消化系统上皮腺癌, 尤其是直结肠癌和胃癌中高表达, 因此在肿瘤细胞内可检测到其转 录本,而在正常成人体内极少表 达。

正常成人体内CEA基因表达

胃肠癌肿瘤组织中CEA基因的表达

在肿瘤发生血道转移时,外周血 中有少量肿瘤细胞残留。用灵敏、 特异的技术检测到这些肿瘤细胞 中CEA基因的转录本,是发现肿 瘤早期转移的关键。

胃肠癌患者外周血中CEA基因的表达

在同一反应体系中加入多对引物,同时扩增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。 三、多重PCR 在同一反应体系中加入多对引物,同时扩增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。 DMD基因外显子缺失的检测

四、差异显示PCR(differential display PCR,DD-PCR)

差异显示RT-PCR(Differential display RT-PCR)

用酶A和B消化,将突变位点引入PCR产物 (一)引入点突变 P2 P1 A B PCR A B 用酶A和B消化,将突变位点引入PCR产物

20 PCR mutagenesis PvuII HindIII EcoRI Isolate products, mix Amplify digest, subclone sequence 20

(二)引入大片段缺失 P3 P1 P4 A B P2 PCR A B PCR B A

第三节 PCR产物的检测

PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP) 等位基因特异性寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO) 单链构象多态性(single strand conformation polymorphism, SSCP) 变性梯度凝胶电泳(DGGE) 融点曲线分析(melting curve analysis) PCR产物的序列分析

一、PCR-RFLP 利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内,可在突变点两侧设计引物,使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离,可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。

RFLPRFLP诊断镰状细胞贫血

s Southern印迹杂交

Results of Southern Blot EcoRI BRCA3 EcoRI Control Tissue Cancer Tissue NIH

Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP PCR-单链构型多态性分析 Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP

PCR-SSCP 单链DNA分子具有特定的二级空间构象,取决于 该分子本身的碱基组成。突变DNA的PCR产物经 在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时,不同构象的 单链片段具有不同的电泳迁移率,从而能区别正 常与突变的DNA 不同顺序 不同构象 不同电泳行为

什么是PCR-SSCP? PCR-SSCP是在完成靶DNA的PCR扩增之后进行单链DNA多态性分析的一种新方法。将单链的扩增DNA或组织基因组DNA通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据其电泳位置的改变可分辨出单个碱基的改变。

SSCP原理 在SSCP凝胶中电泳时,单链DNA的泳动速率主要取决于二级空间结构,因此若DNA片段中碱基发生突变,将会引起单链DNA二级空间结构的改变,使SSCP凝胶上出现异常移动的电泳带(即SSCP 阳性)。

PCR-SSCP 操作步骤 1. 常规PCR扩增DNA片段或其他被标DNA片段的提取。 2.  将提取的DNA在20l变性溶液(95%甲酰胺、1mmol/L EDTA, 0.05%溴酚蓝、0.05%二甲苯青),95℃ 10分钟,冰浴3分钟。 3.  将混合液加到中性的聚丙烯酰胺凝胶板孔中,在含1xTBE的电泳液中,电泳。 4.  将凝胶中DNA片段转移到硝酸纤维薄膜上,烘干后以放射自显影拍摄记录。或银染色

银染原理 根据核酸分子带有多个氨基和亚氨基,一定条件下可以与银离子结合,在甲醛等还原剂的作用下,形成黑或褐色的银沉淀条带。

银染过程 凝胶 10%乙酸、30%乙醇固定10min 0.1%AgNO3 染色10min 2.5%碳酸钠-0.03%甲醛显色 1%乙酸终止 dH2O漂洗 dH2O漂洗两次 dH2O漂洗两次

影响PCR-SSCP的因素 1.DNA片段大小 2.复制错误发生 3.电泳条件 :(1)丙烯酰胺的浓度 (2)交联剂的浓度 (3)电泳的物理环境 (4)甘油浓度

PCR-SSCP与RFLP比较 无需特殊的限制性内切酶作用 可测出理论上任何一个碱基突变位点 操作简便,无需特殊的仪器设备及试剂

PCR-SSCP 的应用 1.基因点突变的监测 2.多态性检测 3. 外显子的筛查 4.cDNA筛查

PCR产物的序列分析(DNA sequencing) 主要见于分子克隆时对于目的基因扩 增片段的序列鉴定以及对致病基因检测时 分析扩增片段中点突变的位置和性质。 可将产物纯化后作为模板直接测序, 也可将PCR产物克隆入载体后再测序,后 者测序的效果更好 ,常用T-A克隆。

Sanger测序技术: 以待测序列的单链DNA作为模板,加入一个引物和dNTP作为底物,并加入一定比例的2’,3’-ddNTP,在DNA聚合酶的作用过程中,正常dNTP的掺入使链延伸,若ddNTP的掺入则使链终止,这样就可以得到一系列长度不同的以四种ddNTP结尾的DNA片段,经电泳后可直接读出碱基序列。

PCR测序演示版 1 2

第四节 PCR技术在分子诊断中的应用

PCR技术在分子诊断中的应用 感染性疾病中病原微生物核酸的检测 单基因遗传性疾病的基因诊断 多基因病相关基因的检测 肿瘤相关基因的检测 移植配型和法医学上的应用

一、感染性疾病的分子诊断 定性或定量检测致病微生物的核酸, 已经用于病毒、细菌和寄生虫感染 的诊断。 动态、定量地检测病原体核酸能对 疗效判断和病情预后提供客观的依 据。

SARS相关冠状病毒的分子诊断 2003年4月,香港研究者Peiris等报 告了50 例SARS病人的临床表现和 病毒学研究结果证明,新冠状病毒 可能是SARS的致病原因。 (Lancet, 2003, 361: 9365) 其它实验室陆续得出相同结论。

2003年4月,德国汉堡Bernhard- Nocht热带医学研究所学者 Drosten 等用随机扩增技术,获得长度为 300 bp的核苷酸序列。 根据这段序列,建立了检测新冠状 病毒的常规和实时定量PCR技术。(www.nejm.com.org on April 10, 2003)

引物和探针 BNIoutS2--BNIoutAs BNI-1片段,189 bp BNIinS--BNIinAs BNITMSARS1—BNITMSARAs2 BNITMSARP(荧光素标记的探针) 产物长度:77 bp

检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺 泡灌洗液 、血浆、粪便。 检测方法 1. 逆转录-巢式PCR 2. 逆转录-实时PCR

结 果 病人和接触者(具临床症状)的痰 液中用外套引物检测到了病毒。 病人的其它标本用套式PCR检测到 病毒。

有报道显示,在可能SARS病人 中, 病毒的检出率为100%。 在疑似SARS病人中的检出率为 23%。 所有健康接触者中未检测到病毒。

检测病毒的3种方 法(血清学检测、 病毒分离、PCR技术)中,PCR技 术的检出率最高。

讨 论 疾病的早期即可获得阳性结果(早 于血清转换期)。 特异性较高(SARS患者中的阳性 率约为80%,对照中的阴性率约为 98%~100%)。 现有的方法敏感性较差,阴性结果 不能排除病毒感染。

讨 论 痰液中病毒RNA浓度极高,说明病毒从呼吸道 排放是主要传播途径。 血清中检测到极低浓度的病毒RNA,提示病毒 复制不仅发生于呼吸道。 便可能也是一种传播途径。 鼻、咽拭子中含有的病毒RNA显著少于痰液, 提示不适合作为标本(有可能漏检)。

SARS相关冠状病毒分子诊断中 必须注意的问题 必须在规范的基因扩增实验室中进行。 应采取必要的质控规程,包括阳性对照 和阴性对照。 阳性结果时必须对原始样本重复检验或 者扩增基因的另一个片段或在另一个实 验室对同一样本进行检测。

其他感染性疾病的诊断 HBV病毒 HIV病毒 …….

二、单基因疾病的诊断 单基因遗传病是由于某一基因结 构的变化或由其而引起的基因表 达异常所导致的疾病,因此用分 子生物学技术检测致病基因的遗 传缺陷是诊断这些疾病最根本的 手段。

1 血友病的分子诊断 X染色体连锁隐性遗传 FⅧ基因和FⅨ基因发生突变 血浆凝 血因子Ⅷ和Ⅸ的合成量和(或)质的异常 患者反复自发性出血

50%的重症血友病A存在22号内含子基因倒位的分子缺陷

(患者扩增出11kb的条带,正常人扩增出12kb的条带,携带者出现11kb/12kb两条条带) 22号内含子基因倒位的直接检测 (患者扩增出11kb的条带,正常人扩增出12kb的条带,携带者出现11kb/12kb两条条带)

血友病A家系间接诊断(一) ——st14位点多态性分析

血友病A家系间接诊断(二) ——bcl I位点多态性分析

2、DMD的分子诊断 X染色体连锁隐性遗传性肌肉疾病,发病率 为1/3 500个男孩 DMD基因位于Xp21.2-21.3,全长2500Kb DMD基因的突变导致dystrophin缺陷 检测DMD基因的技术: Southern印迹、多重PCR

DMD的基因检测 迪谢内肌营养不良 (DMD) 是一种高发病 率、高致残、高致死的X染色体连锁的遗 传性疾病,在2500个活产男婴中即有一 个患者。 致病基因DMD的全长为250kb,有79个外 显子。 DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失, 约占60%~70%。

DMD基因外显子缺失的检测

LGMD2B的基因定位 和遗传缺陷的研究

肢带型肌营养不良(limb-girdle muscular dystrophy, LGMD)是一组累及肩胛、骨盆带 和四肢近端肌肉的遗传性疾病。 LGMD1:显性遗传(1A、1B、1C) LGMD2:隐性遗传(2A~2H) 不同类型的LGMD不仅在遗传学上具高度异质 性(不同致病基因,不同基因突变),临床表 现亦十分不一致,临床诊断和分类十分困难。

ENMC的诊断标准 LGMD的诊断必须符合以下2个标准之一: 1. 致病基因与已知的某一LGMD基因位点 连锁 2. 检测到致病基因编码产物的缺陷

家系资料

先证者 男性,56岁。 初中时发觉体育活动受限,且无法踮脚站立。 以后症状逐渐加重,并伴有下肢肌肉萎缩。四 年前来我院就诊时已无法行走,四肢肌肉萎缩 明显,尤以双侧小腿为甚。肌电图示肌源性损 害,CK值3倍高于正常范围。

致病基因的定位 用迄今已报道的LGMD2A~2H 8个 基因所在位点附近共14个STR标记 对家系成员DNA样本进行连锁分析, 以期找出与该家系连锁的致病基因。

LGMD2A D15S994 15q15.1-15.3 LGMD2A D15S778 LGMD2A D15S779 连锁基因 标记位点 基因定位 LGMD2A D15S994 15q15.1-15.3 LGMD2A D15S778 LGMD2A D15S779 LGMD2B D2S337 2p13 LGMD2B D2S286 LGMD2B D2S2333 LGMD2C D13S175 13q12 LGMD2D D17S1816 17q12 LGMD2D D17S787 LGMD2E D4S1592 4q12 LGMD2F D5S436 5q33-34 LGMD2F D5S422 LGMD2G D17S789 17q11-12 LGMD2H D9S1682 9q31-33

致病基因定位结果 连锁分析显示此家系在D2S377位点的Lod Score值为1.85,在D2S286 位点的Lod score 值为 0.51,其他各位点的值均为负数。统计结果支持 D2S337位点和 D2S286 位点与 LGMD2B 致病基 因连锁。其他各位点与致病基因不连锁。 Lod score值< 1:不支持连锁 Lod score值>1:支持连锁 Lod score值>3:强烈支持连锁

致病基因编码产物检测结果 先证者LGMD2B基因的编码蛋白dysferlin 条带密度与正常对照相比有明显下降,其余各蛋白条带与正常对照相比无明显改变。

DYSF基因突变的检测 在DYSF基因的突变热点区筛查,以期 找出导致 dysferlin缺陷的基因突变。 逆转录PCR 产物克隆至载体后作序列分析

G

DYSF基因检测结果 cDNA第6425/6426位(52号外显子)缺失 1个G碱基 (6425/6426 del G)。 第2019位密码子agg agc,下游读码 发生移码突变,使第2035位密码子 atg tga (53号外显子,M 2035 X)。

终止密码的提前产生是 dysferlin缺陷的 原因。 是尚未报道的一个新突变,也是中国第 一例DYSF基因突变。 根据患者病史、体征和分子诊断实验结 果,这是一个由于 DYSF 基因突变造成 相应编码产物缺陷而导致的疾病。

多基因病具一定的遗传因素,家庭 发病率高于人群发病率,但是疾病 的产生都以一定的环境条件为诱因, 遗传因素在其中所起作用程度各异。 三、多基因病的分子诊断 多基因病具一定的遗传因素,家庭 发病率高于人群发病率,但是疾病 的产生都以一定的环境条件为诱因, 遗传因素在其中所起作用程度各异。

多基因病中的遗传因素是若干个 易感基因微小作用的累加,某一 易感基因结构的变化不足以导致 疾病的产生。

人类基因组多态性是多基因病基因 诊断的基础,易感基因多态性的检 测能帮助我们理解多基因病发生的 机制,有助于对疾病的诊断和分类。

高血压候选基因多态性分析 在EH中的应用前景 临床分型 靶器官损伤 个体化治疗

-内收素 血管紧张素转换酶 上皮钠通道 血管紧张素原 心钠素 2肾上腺素能受体 SA G蛋白亚单位3 基因多态性与盐敏感性高血压 -内收素 血管紧张素转换酶 上皮钠通道 血管紧张素原 心钠素 2肾上腺素能受体 SA G蛋白亚单位3

ACE基因多态性 与高血压靶器官损伤 疾病 研究报告数 I D D D 冠心病 30 + 11 % + 32 % 冠心病 30 + 11 % + 32 % 心肌梗死 15 + 12 % + 39 % 脑卒中 5 + 22 % + 94 % 高血压肾病 19 + 10 % + 53 % 糖尿病肾病 11 + 40 % + 56 % * 与II型相比,DD型和ID型发生上述疾病的危险性增高程度 (145个ACE基因I/D多态性研究49959例的荟萃分析)

基因多态性与高血压靶器官损伤 脑卒中 冠心病 载脂蛋白E 副氧酶 -纤维蛋白原 凝血因子V 血管紧张素原 凝血因子VII 载脂蛋白B 脑卒中 载脂蛋白E -纤维蛋白原 血管紧张素原 血管紧张素II的1型受体 内皮型一氧化氮合酶 心钠素

基因多态性检测与个体化治疗 人类基因组计划已经完成,功能基因组 计划正在实施。 有朝一日,临床医师能根据病人易感基 因的多态性设计有效的、个体化的治疗 方案,以达到最佳的治疗效果。

TOHP试验中的AGT基因研究 目的:观察AGT基因分型与限钠盐摄入及减轻体重后的 血压变化和高血压发病率间的关系 对象:1509例 基因分析:AGT基因G-A多态性 结果: 三年后高血压发生率(%) 对照组 限盐组 减轻体重组 AA型 45 28 25 GG型 32 41 32 Hunt SC,et al: Hypertension, 1998;32:393-401

基因多态性分析 指导抗高血压药物的选择 药物种类 基因 利尿剂 -内收素 ACE抑制剂 ACE、AT1 -受体阻滞剂 G蛋白(Gs)

四、肿瘤相关基因的检测 肿瘤是由于遗传物质(肿瘤相关 基因)发生突变而导致的疾病。 肿瘤相关基因的突变只是增加了 个体对肿瘤的易感性而并不一定 马上产生肿瘤,肿瘤的发生是一 个多因素、多步骤的过程。

生物芯片技术在今后的肿瘤发病机制研究和肿瘤的诊断等方面将发挥越来越显著的作用

P53导致肿瘤发生的 机制

p53 Target Gene Array Total RNA from HeLa or NCI-H23 cells were reverse-transcribed into cDNAs in the presence of Biotin-dUTP. The biotin-labeled cDNA probes were then hybridized individually to the Human TranSignal p53 Target Gene Array.

PCR技术在法医学上的应用 个人认识 亲子鉴定 性别鉴定