STR非变性HPLC快速诊断 唐氏综合征方法的建立及评价 课题进展汇报 STR非变性HPLC快速诊断 唐氏综合征方法的建立及评价 Rapid prenatal diagnosis of Down Syndrome by non-denaturing high-performance liquid chromatography with short tandem repeat markers

概述 唐氏综合征(Down syndrome，DS) ，又称21三体综合征或先天愚型，是人类最常见的染色体数目异常导致的遗传性疾病，是先天智力低下的最常见原因。新生儿发病率约1/800-1/ 600。 DS的遗传分型： （1）21三体型(游离型)：47,XX(XY),+21，占92.5% （2）易位型： 46,XX(XY),-14,+t(14q21q)，占4.8% （3）嵌合型： 46,XX(XY) / 47,XX(XY),+21，占2.7% （4）双重三体，较罕见 （5）21部分三体

研究背景 新生儿的DS发生率约为1‰～2‰，我国目前大约有60 万以上的DS患儿。 因此，建立一种快速、准确、低成本、高通量、自动 化程度高的唐氏综合征产前诊断方法对于优生优育具有 重要意义。

国内外相关产前诊断方法现状： 超声波筛查：通过超声波检查胎儿颈部半透明组织厚度、股骨长度与肱骨长度、心脏异常情况、胎儿鼻骨发育情况、孕早期胎儿静脉导管血流检测等以达到诊断目的。该方法阳性率低，假阳性率高，易漏诊误诊。 孕早、中期母体血清相关标记物结合孕妇年龄筛查：主要相关血清标记物有相关血浆蛋白(PPA)、甲胎蛋白(αFP)、游离雌三醇(µE3)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)。检出率为60-70%，假阳性率5%。 羊水细胞培养、染色体G显带核型分析：经典方法，但费时长(2-3周)，手工操作量大，羊水细胞培养成功率低。 荧光原位杂交(Fluorescence in-situ hybridization，FISH)：该方法准确率高，但同时技术要求高，成本昂贵 。

PCR荧光染料定量分析法：同时扩增21号染色体的人肝型磷酸果糖激酶基因(PEKL2CH21)外显子8和1号染色体的人肌型磷酸果糖激酶基因(PEKM2CH1)外显子9，扩增产物经荧光染料标记后，再用凝胶成像系统对PCR产物进行吸光度分析。该方法操作较繁琐，不能实现对大人群的高通量筛查。 PCR扩增短串联重复序列(Short Tandem Repeats，STR)后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染，进行DNA密度分析：该方法操作繁琐，费时长，灵敏度低，不能实现高通量筛查。 STR荧光定量PCR分析方法：通过分析峰面积比值或出峰个数进行诊断。但该方法成本较高，仅合成标记探针就需数千元，而且在产前诊断方面特异性稍差。

相对以上技术而言，DHPLC技术是一种高通量、快速、准确、灵敏度高、经济、自动化程度高的遗传变异筛查技术, 在非变性温度条件下，可以对不同长度的双链DNA片段进行分离。 近期大量研究发现，多余的片段中含有21q22带，就会患DS，反之则不会患病。表明21q22是DS的关键区域。 STR均匀地分布于人类基因组中，具有高度多态性和高杂合度等特点，并遵循孟德尔共显性遗传规律。 由此引出对本课题的研究。

研究内容 STR位点的选取：通过网上资源及实际分析，选取理论及实际杂合度较高的STR位点。 方法的建立与优化：对所选实际杂合度较高的STR位点进行PCR扩增，利用非变性高效液相色谱技术分离PCR产物中不同片段长度的DNA片段，由不同的峰型可以诊断DS患者并鉴定其染色体的亲代来源。 方法的评价：用细胞培养、染色体G显带核型分析方法同时对所有样本进行确诊，与本课题所建立方法进行双盲评价。

技术路线

研究方案 (1) 标本的收集：收集20例DS家系和100例正常人群外周血标本，家系标本每份分为两组，一组进行细胞培养及G显带核型分析，另一组提取DNA。 (2) STR位点的选取：利用网上资源选取理论杂合度较高(>0.8)的STR位点，然后通过对100例正常人群标本的分析，获得实际杂合度较高的STR位点。 (3) PCR条件的建立及优化： PCR扩增所选实际杂合度较高的STR位点。 (4) 非变性高效液相色谱技术诊断DS方法的建立：分离不同长度的PCR扩增产物，优化条件使本方法可以用于DS产前诊断并鉴定患者染色体的亲代来源。 (5) 评价实验：用细胞培养、染色体G显带核型分析方法与本课题所建立方法进行双盲评价。

特色与创新点 （1）首次将DHPLC技术应用于唐氏综合征产前诊断的研究，目前，国内外均未见报导。 （2）本课题所选取的STR位点均位于21q22带这一关键区域内，且具有高杂合度特点，通过对数个STR位点的同时检测，几乎可以对所有类型的DS做出诊断（嵌合型DS患者体内三体型细胞比例低者除外），可以对99.9%以上的DS患者做出诊断。 （3）本方法同时具有快速、准确、低成本、高通量等其它方法不具备的优点。

课题进展 已完成了21例DS家系标本的采集工作(细胞染色体核型分析确诊工作已完成) ，并已提取DNA，正常人群标本100例也已采集并提取DNA； 初步选定了数个理论杂合度较高的STR位点； PCR循环参数基本确定； DHPLC洗脱条件初步确定，正在进一步优化。

待解决问题 1、DHPLC洗脱条件的优化； 2、引物不纯对本实验的影响。