专题 微生物学质量控制及疾病预防 主讲人：何 学 令 ——————————

内容 一、前言 二、实验动物微生物控制分级 三、实验动物常见感染性疾病 四、实验动物微生物质量控制 五、动物实验中的生物危害和防治

一、前 言

前言 生物学实验研究的四个基本条件 Animal，Equipment，Information，Reagent，简称 AEIR四要素。 这4个要素在整个实验研究中具有同等重要的地位， 不能忽略或偏废。事实上，实验动物质量往往成为制约性 要素，影响整个实验的质量和水平。 实验动物质量监测是实验动物科学的重要内容，是确 保实验动物质量的必要手段。

前言 实验动物质量控制 遗传质量控制 微生物质量控制 营养质量控制 环境质量控制

前言 微生物控制的意义 工作人员的健康和生命的保证 实验结果准确性、规律性、重复性的保证 生产标准实验动物的保证

二、实验动物微生物控制分级

实验动物微生物控制分级 按微生物学控制标准或微生物净化程度，分为四级： 普通动物(Conventional animal, CV) 清洁动物(Clean animal, CL) 无特定病原体动物(Specific pathogen free animal, SPF) 无菌动物(Germfree animal, GF)和悉生动物(Gnotobiotic animal, GN)

实验动物微生物控制分级—普通动物 普通动物（Conventional animal，CV动物） 定 义：不带有严重危害动物自身健康和人兽共患病病原体的动 物，是在微生物学控制上要求最低的动物。 饲养条件：开放系统 来 源：经微生物学检查不带有上述病原体的动物，或SPF动物降 级。

实验动物微生物控制分级—普通动物 微生物学特点 饲养管理 生理学特点 要求不携带所规定的人兽共患病病原和动物烈性传染病的病原。 饲养于开放系统。但仍然对温度，湿度，饲料，垫料，饮水，卫生等有一定控制。 生理学特点 外观健康，饮食排泄正常，无异常分泌物，无临床症状，脏器无 眼观病灶。

实验动物微生物控制分级—普通动物 普通实验动物的应用 仅可作为生物医学中教学示教之用 作为某些科学研究为探索方法而从事的预试验之用 不可供科研、生产和检定之用。

实验动物微生物控制分级—清洁动物 清洁动物（Clean animal，CL动物） 定 义：除普通动物因排除的病原外，不携带对动物危害大和对科 定 义：除普通动物因排除的病原外，不携带对动物危害大和对科 学研究干扰大的病原，又称二级动物。 饲养条件：半屏障系统内 来 源：SPF动物扩群 应 用：各种科研、教学用

实验动物微生物控制分级—清洁动物 微生物特点： 饲养管理： 清洁级动物比普通级动物要求排除的微生物和寄生虫多，但比 SPF动物少。清洁级动物除肉眼观察无病外，尸体解剖时，主要脏器、 组织无论是肉眼观看还是病理组织切片均应无病变。 饲养管理： 清洁级动物饲养于温湿度恒定的半屏障系统中。其所用的饲料、 垫料、饮用水、笼器具等都经过消毒灭菌处理。工作人员需换灭菌工作 服、鞋、帽、口罩等进入动物室进行操作。

实验动物微生物控制分级—清洁动物 应用： 清洁级动物是根据我国国情而设立的等级动物，它较普通级 动物健康，又较SPF级动物易达到质量标准，在动物实验中可免受 动物疾病的干扰，其敏感性与重复性亦较好。是目前我国目前主 要使用的质量控制等级的动物，已被广泛地应用于生命科学研究、 新药研制和安全评价等领域的动物实验之中。

实验动物微生物控制分级—SPF动物 无特定病原体动物（Specific pathogen free animal，SPF） 定 义：指不携带特定病原体（细菌、病毒、寄生虫），但带有未知 的微生物群的动物。 饲养条件：屏障系统内大规模生产/隔离器内保种 来 源：将无菌动物/悉生动物转 移到屏障系统中饲养繁殖

实验动物微生物控制分级—SPF动物 SPF动物的特点 微生物特点：SPF动物除普通级、清洁级动物应排除的病原体外， 不携带主要潜在感染或条件致病和对研究实验干扰大的 病原。 饲养管理：SPF动物必须饲养在温湿度恒定的空气净化的屏障系统中， 实行严格的微生物控制。

SPF动物的应用 标准级别的实验动物。它的应用价值在于它无人畜共患 病，无主要传染病，无对实验研究可能产生干扰的微生 国际上“SPF”一词的含义并不十分同一，“SPF”是多年来 使用的名称，目前还没有更好的统一的名称，所以仍沿用。 现在有COBS（经剖腹产取得并饲养在屏障中的）、BS（在 屏障系统中饲养）、DF（无病）等不同名称，都是指“SPF” 动物。

实验动物微生物控制分级—无菌动物 无菌动物（Germfree animal，GF） 定义：指用现有的实验手段检测，动物的体表体内不携带其它生命体（包括 一切微生物和寄生虫）的实验动物。 饲养条件：无菌隔离器内 来源：第一代通过无菌剖腹产术，人工哺 乳获得；以后通过无菌动物雌雄交配繁殖 或无菌剖腹产术，保姆鼠代奶扩群。

实验动物微生物控制分级—无菌动物 无菌动物的特点 微生物特点： 在动物体内外任何部位均检不出任何活的微生物和寄生虫。此 微生物指病毒、立克次体、细菌（包括螺旋体、支原体）、真菌和原虫。 “无菌”是个相对的概念，只是根据现有的科学知识和检验方法在一定 时期内不能检出病原体而已。随着科学技术的发展，现在认为是无菌的 动物或许将来可以检出病原体而不是无菌动物。

实验动物微生物控制分级—无菌动物 形态学特点 消化系统：盲肠膨大；肠道肌层薄，肠绒毛变细变短 循环系统：心脏变小；白细胞数变少、数量波动范围小 免疫系统：胸腺、淋巴组织、网状内皮系统发育不良； 脾脏小

实验动物微生物控制分级—无菌动物 生理学特点 免疫功能：血清中IgG、IgM水平低，几乎不存在丙种球蛋白和特异性抗体；免疫应答速度慢，过敏反应、对异体移植物的排斥反应以及自身免疫现象消失或减弱。 代谢和营养：肠管对水的吸收率低，代谢周期比普通动物长；体内不能合成维生素B和K，易产生这两种维生素的缺乏症。 繁殖能力和寿命：无菌动物繁殖力高于普通动物，寿命比普通动物长。 抗辐射能力强

实验动物微生物控制分级—悉生动物 悉生动物（Gnotobiotic animal，GN） 定 义：又称已知菌动物，指体内带有明确的微生物种类的动物。 饲养条件：无菌隔离器内 来 源：人为将已知的微生物投 给无菌动物，使其体内带有已知菌 单菌动物 双菌动物 多菌动物

实验动物微生物控制分级—悉生动物 悉生动物的特点 微生物特点：体内携带有已知微生物 饲养管理：必须饲养在温湿度恒定的空气净化的隔离系统中，实行严 格的微生物控制。 与无菌动物比较，悉生动物肠道内存在细菌可以合成维生素，不会 像无菌动物一样发生维生素缺乏症。抵抗力、生活力较强，易于饲养理。

无菌动物和悉生动物的应用 病因学的研究，如：猫瘟 微生物学中的研究： 免疫学研究中的应用： 肿瘤学研究，如：苏铁素 微生物间的拮抗作用，如：照射后出现的假单孢菌 微生物和宿主之间关系 病毒学研究：病毒病、安全疫苗、单一特异性抗血清 免疫学研究中的应用： 无菌动物体内既无抗原也无特异性抗体，处于一种“原始状态”，很适合 用于各种免疫功能的研究。 肿瘤学研究，如：苏铁素 老年病学研究：无菌动物寿命比普通动物长，说明微生物和机体老化有关

无菌动物和悉生动物的应用 营养学的研究：无菌动物是研究营养的良好模型，很多营养成分是 靠细菌产生的。如VB和VK是靠肠道细菌合成的，无菌动物体内不能合成VB和VK，所以可以用来研究哪些细菌合成了哪些维生素。 放射医学研究：无菌动物可以耐受大剂量的放射线照射。可用区别 放射引起的症状和继发感染的症状。 毒理学研究：研究发现青霉素过敏是因为肠道菌代谢引起，而非青 霉素本身。豆类中毒也是由肠道细菌的代谢活动引起的。 其他学科研究:可以用于代替人类进入宇宙和宇航食品；无菌剖腹产和养育；口腔龋齿发生等。

实验动物微生物控制分级 不同微生物控制的实验动物的比较 无菌动物 隔离系统 用现有方法不能检出任何微生物和 寄生虫的动物。 种类 饲养环境 概念 无菌动物 隔离系统 用现有方法不能检出任何微生物和 寄生虫的动物。 悉生动物 隔离系统 确知所带有的微生物 SPF动物 屏障系统 确知不带有的微生物。 清洁动物 半屏障系统 不携带对动物危害大,对科学研究 干扰大的病原微生物。 普通动物 开放系统 不携带人畜共患病和动物烈性传 染病原体的动物。

三、实验动物常见感染性疾病

实验动物常见感染性疾病 实验动物感染性疾病概念： 实验动物常见感染性疾病包括——人兽共患病、动物烈性传染病、一般性疾病、寄生虫疾病。 人兽共患病——指人类也可感染发病的一类动物疾病。 病原体感染的表现形式——显性感染、隐性感染、病原携带状态、潜伏感染。

实验动物常见感染性疾病-人兽共患病 导致人兽共患病的主要病原体： 病毒： 流行性出血热病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒狂 病毒： 流行性出血热病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒狂 犬病病毒、猴疱疹病毒（B病毒） SARS、AIV等。 细 菌： 沙门氏菌、布氏杆菌、志贺氏菌、结核分枝杆菌等。 真 菌： 皮肤病原真菌（石膏样毛癣菌、石膏样小孢子菌、羊 毛状小孢子菌、新生隐球菌、荚膜组织 胞浆菌）等。 寄生虫： 弓形体、钩端螺旋体病等寄生虫

实验动物常见感染性疾病-烈性传染病 病毒：鼠痘病毒（小鼠脱脚病病毒）、兔出血症（兔 瘟）病毒、犬细小病毒（急性出血性肠炎）、 犬瘟热病毒等。 一般疾病病原体： 病毒：小鼠肝炎病毒、仙台病毒、猴D型反转录病毒等。 细菌：多杀巴氏杆菌、泰泽氏菌、鼠棒状杆菌、肺支 原体等。 寄生虫：多种体内外寄生虫。

实验动物常见感染性疾病-病毒性疾病 流行性出血热（肾综合征出血热HFRS）： 传 染 源：流行性出血热病毒（汉坦病毒）。带病毒黑线姬鼠 和褐家鼠为主要传染源，实验大鼠也偶尔传播。 传播途径: 污染尘埃飞扬形成气溶胶吸入感染。带病毒的血、 尿污染人皮肤破损处，也使人患病。 易 感 者: 人、大鼠、小 鼠、豚鼠、兔。 症 状: 潜伏期14天，人感染后出现高热、出血、休克、 肾功能受损和循环衰竭，严重者死亡。

实验动物常见感染性疾病-病毒性疾病 EHF已构成的危害 2001年6月，正当我国“申奥”的关键时刻，北京发生了因使用质量不合格实验动物和动物实验不规范致使鼠源性人兽共患病流行性出血热感染一名院士死亡和700多师生紧急预防接种的重大事件。消灭了所有普通级的实验大小鼠。提高标准，修订实验动物管理法规。 2002年11月湖北省药检学校的一名毕业生在某药厂从事动物实验工作，由于接触了带出血热病毒的实验动物而感染流行性出血热不治死亡。

实验动物常见感染性疾病-病毒性疾病 EHF已构成的危害 2006年，东北三省由于个体户繁养暨长途贩运不合格实验动物致使几十名教学科研人员感染流行性出血热重大疫情的发生，已引起科技部门高度重视。 在广东省，1990年和1997年分别出现的科技人员使用不合格实验动物而感染人畜共患病的严重生物安全事故。1999年博士后张某进入某大学博士后流动站从事“九五”国家攻关课题——补肾法治疗老年性痴呆的实验时与实验用大鼠接触，三个月后感染鼠源性流行性出血热，至2003年被诊断为肾功能衰竭，2006年进行肾移植手术。

实验动物常见感染性疾病-病毒性疾病 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎 传 染 源: 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。带病毒野小鼠或实 验小鼠为传染源。 传播途径: 带病毒小鼠的分泌物、排泄物污染，吸血昆虫传 播，胎盘垂直传播。 易 感 者: 人，小鼠、猴、豚鼠、大鼠、地鼠、兔、狗、鸡等。 症 状: 人感染后表现类似流感样症状， 临床表现：大脑型、内脏型、迟发型。

实验动物常见感染性疾病-病毒性疾病 鼠痘（小鼠传染性脱脚病） 传 染 源：鼠痘病毒。患病或带病毒小鼠是传染源。 传播途径：接触病鼠的渗出物、分泌物及其污染的物品。 易感动物：小鼠，特别是A系、C3H、DBA/2、BALB/C、CBA等品 系小鼠。

实验动物常见感染性疾病-细菌性疾病 实验动物细菌感染归纳起来包括三个方面： 人兽共患病原菌和动物致病菌 这类细菌中代表性的是沙门氏菌、志贺氏菌、布氏杆菌、 结核分枝杆菌等，不仅可以引起实验动物的严重疾病，而且也是 人类的重要致病菌，应予以排除，确保人与动物的安全。 条件性致病菌 当动物在某些诱因的作用下，机体抵抗力下降，导致疾病发 生，甚至流行。条件性致病菌对动物的影响相对比较严重。 正常菌群的细菌（菌群失调） 各种细菌即使是正常菌群，在动物体内的存在都会影响其生 理参数和实验的重复性。这些变化又可将对动物结果产生不同程 度的干扰和影响。

实验动物常见感染性疾病-细菌性疾病 沙门氏菌病 传 染 源：沙门氏菌。携带该菌的野鼠、苍蝇、动物粪便，病 鼠是传染源。 传播途径：粪便污染垫料、饲料、饮用水后，经消化道感染。 易 感 者：大鼠、小鼠、 豚鼠、兔。 症 状：食少和腹泻，急性暴发型可导致动物迅速死亡。

实验动物常见感染性疾病-支原体疾病 支原体疾病 传 染 源：支原体（肺支原体、溶神经支原体和关节炎支原体） ，患病或携带病原体的小鼠、大鼠。 传播途径：带菌母鼠舔仔鼠，气溶胶传播，经污染笼具间接接触。 易感动物：大鼠、小鼠。 症 状： 肺支原体（呼吸系统疾病：鼻炎、肺炎，并发中耳 炎-“歪头病”。母鼠死胎或不育） 溶神经支原体（小鼠旋转病） 关节炎支原体（大鼠多发性关节炎）

实验动物常见感染性疾病-寄生虫疾病 弓形体病 传 染 源：袭地弓形虫。其感染性卵囊和含弓形体的包囊可感 染导致发病。 传播途径：成熟卵囊污染的食物或含弓形体包囊的肉类被食用。 易 感 者：人，猫、小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、地鼠、犬、猴。 症 状; 在脏器（肠道、眼、心、脑、肺、肌肉、肝、脾等） 形成肉芽肿性炎症和坏死，并引起相应症状。

实验动物常见感染性疾病-寄生虫疾病 弓形体病 弓形虫是实验动物必须排除的寄生虫 传 染 源：龚地弓形虫。其感染性卵囊和含弓形体的包囊可感 染导致发病。 传播途径：成熟卵囊污染的食物或含弓形体包囊的肉类被食用。 易 感 者：人，猫、小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、地鼠、犬、猴。 弓形虫是实验动物必须排除的寄生虫

实验动物常见感染性疾病-寄生虫疾病 弓形虫的感染途径 经口感染 经胎盘感染 经皮肤、粘膜感染实验动物 危害性 动物感染弓形虫后，经血液散布全身，在网状内皮 细胞和实质脏器细胞内繁殖，轻者无临床症状，表现为 隐性感染，重者产生出血灶，坏死灶，动物死亡。妊娠 动物出现流产或死胎。

实验动物常见感染性疾病-真菌疾病 弱，一般为慢性过程，多呈散发性，病理变化缺少特征性，多 病原真菌大多数为人兽共患病，其病原性比其它微生物 弱，一般为慢性过程，多呈散发性，病理变化缺少特征性，多 以慢性增生性炎症为主。机体免疫功能正常，不易发生真菌感 染，而免疫功能低下，特别是细胞免疫功能低下时，常发生真 菌感染。 由于真菌孢子容易飞扬，因此，实验动物患有真菌病，不 仅影响科学实验的准确性，而且容易污染环境，威胁动物群体 以及饲养人员和实验人员的健康。一旦发现实验动物被真菌感 染，应立即将该饲养单元的所有动物一并处死、焚烧，防止隐 性感染动物可能造成的对其他动物、饲养人员、实验人员及环 境的污染。

四、实验动物微生物质量控制

实验动物微生物质量控制 坚持预防为主的原则，控制动物流行病的三个基本环 节—传染源、传播途径和易感动物，进行卫生防疫与消毒灭 菌。 采取积极措施控制实验动物微生物、寄生虫质量检测， 保证实验动物的质量。检测的种类： 实验动物病毒学检测 实验动物细菌学检测 实验动物真菌学检测 实验动物寄生虫学监测

实验动物微生物质量控制 实验动物疾病的预防措施 注意以下几点： 隔离饲养 引进动物要严格检疫。 坚持卫生消毒制度。 要严格遵守国家颁布实施的实验动物饲养管理条例、法规。 注意以下几点： 隔离饲养 引进动物要严格检疫。 坚持卫生消毒制度。 饲养管理人员要定期进行健康检查。 保种单位要对保种的动物定期进行质量检查，发现问题及时更新种群。 动物的预防接种 防止野生动物进入实验动物室，死亡动物进行无害化处理。

实验动物微生物质量控制 寄生虫监测程序

实验动物微生物质量控制 微生物监测程序

实验动物微生物质量控制 检测方法 细菌检测:分离培养的方法，其中泰泽病原体采用免疫荧光初筛，再分离病原的方法；结核分枝杆菌和布鲁杆菌采用免疫学检测方法。 病毒检测:免疫学检测方法，免疫酶、免疫荧光以及ELISA试验。目前我们所检测的病毒一般都可以用免疫酶实验进行，其中汉坦病毒、仙台病毒采用免疫荧光实验。 寄生虫检测:直接显微镜镜检，其中弓形虫检测采用间接血凝实验检测抗体。

实验动物微生物质量控制

实验动物微生物质量控制

实验动物微生物质量控制

实验动物微生物质量控制

实验动物微生物质量控制

实验动物微生物质量控制

实验动物微生物质量控制

实验动物微生物质量控制

五、动物实验中的生物危害 及防治

动物实验中的生物危害及防治 生物危害（biohazard） 是指在生命科学中，由于实验人员的错误操作，而 动物实验中发生的危害的原因： 使有害病原体散播到外界，污染外界环境，并造成周围 人及动物感染发病。 动物实验中发生的危害的原因： 在用实验动物进行生命科学研究时，生物危害产生 于实验者、实验动物及实验环境三大要素。

动物实验中的生物危害及其防治 实验动物 普通级实验动物 由于我国现阶段常使用普通动物，所以在开放环境中，常常 可能有携带病原体的各种媒介昆虫及野鼠进入，把各种病原体感 染实验动物。 野生动物 利用像灵长类动物等作为实验动物时，由于其生物学特性， 多采用野生，或短期人工繁育训化的动物，对其遗传背景，体内 携带的病原体不清楚，往往发生生物危害的可能性最大。

动物实验中的生物危害及其防治 动物实验和饲养环境设施不完善，野鼠和昆虫出 仪器设施不完善 入自由，将外界病原体带入，也可将实验病毒带到外界 环境。各种隔离和消毒设施不完善，增加生物危害的发 生。

动物实验中的生物危害及防治 可影响人类健康或是造成不舒适具潜在风险 生物性危害： 感染 过敏 中毒 心理恐慌

动物实验中的生物危害及防治 感染（Infection）：生物体在人体内繁殖生长所致(如：流行性感冒、麻疹、肺结核) 过敏（Allergy）：生物体以过敏原角色经重覆暴露致使人体免疫系统过度反应所致(如：过敏性肺炎、气喘、过敏性鼻炎) 中毒（Toxicity）：暴露于生物体所产生之毒素（细菌内毒素、细菌外毒素、真菌毒素）所致(如：发烧、发冷、肺功能受损)

动物实验中的生物危害及防治 心理的恐慌

动物实验中的生物危害及其防治 传播途径——生物性物质主要传播方式 血液体液 刀械、针器 实验动物咬伤 空气 离心、气悬、搅拌 实验动物喷嚏

动物实验中的生物危害及其防治 生物危害分级 (NSC) RG1：与健康成人之疾病无关 如：E . coli - K12, 未详列 如：病毒、批衣菌、细菌、真菌、寄生虫 病毒如：Dengue virus serotype 1-4（登革病毒）, Hepatitis A-E virus（肝炎）, measles virus, Mumps virus（腮腺炎）, Coxsackie viruses type A&B（柯萨奇病毒）

动物实验中的生物危害及其防治 生物危害分级 (NSC) RG3：可引致人类严重或致死疾病，可能有预防或治疗方法 如：变性蛋白（Prions）、病毒、立克次体、细菌、真菌 Transmissible spongioform encephalopathies (TME) ( 海绵状脑病)Hantaviruses（汉坦病毒）, HIV type1&2、 SARS-CoV,Mycobacterium tuberculosis(结核分枝杆菌) RG4：可引致人类严重或致死疾病，通常无预防及治疗方法 如：病毒 Ebola virus(埃博拉病毒) Marburg virus(绿猴病病毒) Tick-borne encephalitis virus(森林脑炎)

动物实验中的生物危害及其防治 预防与控制一般原则 污染源清除 维持环境清洁与卫生并定期消毒 空气质量管理 遵守微生物实验室操作守则 个人防护设备的使用 个人卫生的加强(如:勤洗手)

动物实验中的生物危害及其防治 标准微生物操作 实验进行中的门禁管制 洗手 禁止饮食、抽烟、处理隐形眼镜、化妆 消毒工作台面 禁止以口吸取液体 减少喷溅及气雾的产生 高温高压灭菌处理所有培养物、储存物及其他具感染废弃物 以防穿刺、防泄漏、可密封的容器运送尖锐物品与检体

动物实验中的生物危害及其防治 生物安全柜

动物实验中的生物危害及其防治 生物安全柜

动物实验中的生物危害及其防治 个人呼吸防护具之选择与使用 效能： 防尘还是防毒？ 有效： 过滤能力（相对风险）？ 国际验证？密合状况？ 配戴正确？ 舒适：通气阻抗？

动物实验中的生物危害及其防治 预防动物实验中生物危害的发生措施 加强实验动物的管理 规范操作 使用标准化的实验环境 加强职业道德教育

动物实验中的生物危害及其防治 结束语 多大的风险 -- 多大的防护 未知的风险 -- 保守谨慎的态度 多大的风险 -- 多大的防护 未知的风险 -- 保守谨慎的态度 对病原菌特性、传播途径、致病机制、诊断与治疗 的知识与经验累积 – 改变风险的程度