血清碱性磷酸酶活性测定（磷酸苯二钠法） 三峡大学医学院生化教研室
引言 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方法。酶测定约占目前临床生化总工作量的1/4到1/2。 用于诊断的酶类已超过100多种，常用的数十种。
引言 一些酶在不同器官、组织、细胞内的分布和定位存在明显差异，而且在细胞内外有明显浓度梯度差。 正常情况下血清中酶活性相对恒定。但一些病理情况常导致血清中酶活性的改变。性别、年龄、运动、妊娠、人种及环境因素等可引起人血清中某些酶的生理性变化。 所以酶与其它指标相比具有更高的诊断特异性和灵敏度。
诊断常用血清酶的来源 血清酶 符号 来源 鸟氨酸氨基甲酰转移酶 OCT 肝 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT 肝 谷氨酸脱氢酶 GLDH 肝 血清酶 符号 来源 鸟氨酸氨基甲酰转移酶 OCT 肝 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT 肝 谷氨酸脱氢酶 GLDH 肝 山梨醇脱氢酶 SDH 肝 丙氨酸氨基转移酶 ALT 肝、肾、心 异柠檬酸脱氢酶 ICD 肝、胎盘、心 -谷氨酰转肽酶 -GT 肝、胆、肾、小肠 5ˊ-核苷酸酶 5ˊ-NT 肝、胆道 单胺氧化酶 MAO 肝、肾、脑 天门冬氨酸氨基转移酶 AST 心、肝、骨骼肌 肌酸激酶 CK 骨骼肌、心、脑 乳酸脱氢酶 LDH 心、肾、骨骼肌、肝、肺 碱性磷酸酶 ALP 骨骼、牙齿、肝、肾 酸性磷酸酶 ACP 前列腺、红细胞、血小板 淀粉酶 AMS 胰、唾液腺 脂肪酶 LPS 胰
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP or AKP ) ALP is a hydrolase enzyme responsible for removing phosphate groups from many types of molecules, including nucleotides and proteins. most effective in an alkaline environment ALP几乎存在于机体各个组织，但以骨骼、牙齿、肝脏和肾脏中含量较多，儿童期含量尤其多。 临床上测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的诊断。
碱性磷酸酶的临床意义 1.生理性增加：如儿童、妊娠期、进食高糖、高脂肪食物等均可使血清ALP活性增高。 2.病理性改变： 升高 （2）各种骨骼疾病。ALP主要由成骨细胞产生，故骨骼病特别是有新生骨质生成时，血液内ALP活性增加，以促进磷酸盐的沉积。如佝偻病、纤维性骨病、成骨不全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等均引起血清ALP升高。 降低：主要见于呆小症，磷酸酶过少症等。
问题： 如何测定酶活性？
酶活性的概念 常用单位时间内底物的减少量或产物的生成量（即酶促反应速度）来表示酶活性大小 酶活性：酶催化某一化学反应的能力 常用单位时间内底物的减少量或产物的生成量（即酶促反应速度）来表示酶活性大小 注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。
酶活性的测定方法 终止测定法（或定时法）：通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。 连续监测法：连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。 适用于自动生化分析仪 目前已取代终止测定法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法
问题： 测酶活性应注意哪些方面？
酶最适反应条件的选择 合适的底物与最适底物浓度 理想的缓冲液与最适离子强度 最适温度 如何控制？ 最适pH 如何控制？ 底物浓度远远高于酶浓度 理想的缓冲液与最适离子强度 最适温度 如何控制？ 最适pH 如何控制？ 合适的辅因子、激活剂浓度 合理的测定时间 对于终止测定法，需在酶作用一段时间后，加入合适的终止剂终止酶促反应。 尽量去除各种抑制剂
问题： 如何表示酶活性大小？
酶活性单位 定义： 分类： 在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物（或得到一定量的产物）所需要的酶量。 惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。 国际单位(International unit, IU)：指在规定条件下，每分钟转化1mol底物的酶量。 Kat单位：指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶量，1Kat=6×107IU。
实验目的 熟悉血清碱性磷酸酶活性的测定方法 （磷酸苯二钠法） 掌握血清碱性磷酸酶测定的临床意义
实验原理 测定ALP活性的方法主要分为两种 一是测定底物解离下的磷酸根来计算酶活力，如β-甘油磷酸钠法，但存在血清本身有磷酸根的缺点； 二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物，这种方法又可分为： 酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定（如本次实验方法）。 生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色，如对硝基苯磷酸二钠（PNPP）法。 无色的对硝基苯磷酸二钠在ALP的作用下，生成在405nm处有特异吸收的淡黄色对硝基苯酚。通过测定在405nm处吸光度的变化速率来计算ALP的活性。
实验原理（磷酸苯二钠法） 在pH10环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠。 苯酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成醌衍生物。 可根据红色深浅测定酶活性的大小。 K3Fe(CN)6
试剂 1、碳酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH10.0)：溶解无水碳酸钠6.36g，碳酸氢钠3.36g。4-氨基安替比林1.5g于蒸馏水800ml中，将此溶液转入1L容量瓶内，加蒸馏水到刻度。棕色瓶中贮存。 2、磷酸苯二钠底物液(20mmol/L) 3、铁氰化钾溶液：铁氰化钾，硼酸 作用：终止反应，显色 4、酚标准应用液：0.05mg/ml
实验操作 立即混匀。用510nm波长比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。 T S B C 血 清(ml) 0.1 — 酚标准液(ml) pH10碳酸盐缓冲液(ml) 1.0 混匀。37℃水浴保温5分钟，同时将底物液预热 底物液(ml) 混匀。37℃水浴准确保温15分钟 铁氰化钾溶液(ml) 3.0 立即混匀。用510nm波长比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。
计算 金氏单位（Kings）定义：每100ml血清在37℃与底物作用15分钟，产生1mg酚为1个金氏单位。 参考值 成人：3~13金氏单位； 儿童：5~28金氏单位
【注意事项】 1、铁氰化钾溶液应避光保存，如出现蓝绿色即作废。 2、底物液中不应含有酚，如含有酚时空白管显红色，说明磷酸苯二钠已开始分解，不宜继续使用。 3、加入铁氰化钾后必须迅速混匀，否则显色不充分。 4、一般血清标本可以共用对照管，黄疸血清及溶血血清应分别作对照管。
讨论 结合参考值范围、临床意义等分析本小组的实验结果 思考题
下周实验 口服葡萄糖耐量试验 ，血糖测定（GOD-POD法） 书写预习报告 制作ppt并发言 组长安排本次做清洁的同学