高中生物选修1 ※ 专题2 微生物培养与应用 课题1——微生物的实验室培养 2017/2/28

主要 内容 微生物类群基本知识； 培养基; 菌落; 无菌技术。 2017/2/28

微生物类群基本知识 病毒与亚病毒 原核微生物 真核微生物 细菌 蓝藻 放线菌 支原体 立克次氏体 衣原体 酵母菌 霉菌 蕈菌（蘑菇）

微生物类群基本知识 真病毒（Euvirus） 非细胞生物 亚病毒（subvirus） 至少含有核酸和蛋白质两种组分。 类病毒：只含具有独立侵染性的RNA组分 拟病毒：只含不具独立侵染性的RNA组分 朊病毒：只含单一蛋白质组分

微生物类群基本知识 2017/2/28 病毒几乎可以感染所有的细胞生物，并具有宿主特异性 噬菌体（phage） 植物病毒（plant viruses） 动物病毒（animal viruses） 2017/2/28

微生物类群基本知识 病毒 单链（ss）双链（ds）

微生物类群基本知识 病毒培养 动物接种 鸡胚接种（常用的病毒培养法之一 ） 组织培养（应用最广的方法 ） HeLa细胞是病毒实验室最常使用的细胞之一。

微生物类群基本知识 细菌细胞壁的功能： （1）固定细胞外形和提高机械强度; （2）为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需; （3）渗透屏障，阻拦酶蛋白和某些抗生素等大分子物质（分子量大于800）进入细胞，保护细胞免受溶菌酶、消化酶和青霉素等有害物质的损伤; （4）细菌特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的 敏感性的物质基础;

微生物类群基本知识 细菌的原生质体(protoplast) 在人为条件下，用溶菌酶处理或在含青霉素的培养基中培养而抑制新生细胞壁合成而形成的仅由一层细胞膜包裹的，圆球形、对渗透压变化敏感的细胞。

微生物类群基本知识 细菌细胞膜的生理功能 ①选择性地控制细胞内、外的营养物质和代谢产物的运送； ②是维持细胞内正常渗透压的屏障； ③合成细胞壁和糖被的各种组分（肽聚糖、磷壁酸、LPS、荚膜多糖等）的重要基地； ④膜上含有氧化磷酸化或光合磷酸化等能量代谢的酶系，是细胞的产能场所； ⑤是鞭毛基体的着生部位和鞭毛旋转的供能部位；

微生物类群基本知识 细菌细胞质的主要成分: 核糖体 贮藏物 多种酶类和中间代谢物 质粒 各种营养物和大分子的单体等

真核微生物 显微藻类 植物界： 动物界： 原生动物 菌物界 粘菌 假菌 真菌 单细胞真菌——酵母菌 丝状真菌——霉菌 大型子实体真菌——蕈菌 1.小球藻 2.杜氏藻 3.变形虫 4.草履虫

微生物类群基本知识 金针菇 蕈菌广泛分布于地球各处，在森林落叶地更为丰富。 毛头鬼伞 美丽粘草菇 深凹杯伞 蒙古口蘑 草菇 鸡腿菇 1.蒙古口蘑：又称白蘑、白蘑菇、蒙古口蘑（内蒙古）。 　　子实体白色。菌盖宽5-17cm，半球形至平层。白色，光滑，初期边缘内卷。菌肉白色，厚。菌褶白色，稠密，弯生，不等长。菌柄粗壮，白色，长3.5-7cm，粗1.5-4.6cm，内实，基部稍大。 　　夏秋季在草原上群生并形成蘑菇圈。 　　分布于我国河北、内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁等地区。 　　此种菌的菌肉肥厚，质地细致，郁香醇正，味独特鲜美。是我国北方草原盛产的“口蘑”之最上品，传统畅销于国内外市场。根据子实体大小、产地不同等特点，分有许多商品名称，如幼小未开伞的称“珍珠蘑”，开伞后的称“片蘑”等。 　　还可供药用，性平，味甘。能宣肠益气，散热，解表。治小儿麻疹欲出不出，烦燥不安，可用幼小晒干的“蘑菇钉”9克，水浸软后切碎，水煎服，一次服完，日服二次。有抗癌活性。此种蘑菇目前还未驯化栽培成功，可能它与某些草本植物有共生关系，也可能与土壤微生物区系及其形成的营养化学成分有关。现阶段这种资源越来越少，生态环境受到不同程度的破坏。保护资源的生态环境和研究人工驯化技术是重要的任务。 2.深凹杯伞：子实体较小。菌盖直径5-8cm，扁半球形至扁平，后中部下凹呈漏斗状，表面干，光亮，浅土红至浅粉褐色。菌褶延生，密，污白色，不等长；菌柄细长，圆柱形，长4-8cm，粗0.4-1cm；菌盖色浅，内部松软。 　　夏秋季在阔叶林中地上生长。 　　分布在我国云南、四川等地区。 　　可食用 3.美丽粘草菇（有毒）：子实体中等大，白色，菌盖直径6-10cm，初期近圆形，后期近平展。菌肉白色。菌褶白色变粉红色。菌柄细长，长6-15cm，粗0.6-1.3cm，圆柱形。菌托苞状而大。 　　夏秋季生林中地上，单生或群生。 　　分布于我国湖北、湖南、四川、吉林、新疆、香港等地。 　　有毒，不可食用。   4.毛头鬼伞（有毒）：又称鸡腿蘑（河北、山西）、毛鬼伞。 　　子实体较大。菌盖呈圆柱形，当开伞后很快边缘菌褶溶化成墨汁状液体。菌盖直径3-5cm，高9-11cm，表面褐色至浅褐色，随着菌盖长大而断裂成较大型鳞片。菌肉白色。菌柄白色，圆柱形，较细长，且向下渐粗，长7-25cm，粗1-2cm，光滑。 　　春至秋季在田野、林缘、道旁、公园内生长，雨季可甚至在毛屋顶上生长。此菌有时生长在栽培草菇的堆积物上，与草菇争养分，甚至抑制其菌丝的生长。 　　分布于我国黑龙江、吉林、河北、山西、内蒙古、甘肃、新疆、青海、西藏等地区。 　　该蘑菇一般可食用。但含有石碳酸等胃肠道刺激物，还含有腺嘌呤，胆碱，精胺，酪胺和色胺等多种生物碱以及甾醇脂等。食后可能引起中毒，与酒类如啤酒同吃容易引起中毒。 　　毛头鬼伞可人工栽培，不过因为成熟快，容易出现菌褶液化，必须掌握采摘时间。还可以用菌丝体进行深层发酵培养。 美丽粘草菇 深凹杯伞 金针菇 蒙古口蘑

猴头 灵芝 银耳 冬虫夏草 竹荪 羊肚菌 榆黄菇 1.榆黄菇： 2.鸡腿菇 3.羊肚菌 4.草菇：子实体较大，菌盖直径5-19cm，近钟形，后伸展，中部稍凸起，干燥，灰色至灰褐色。中部色深，具辐射的纤毛状线条。菌肉白色，松软，中部梢厚。菌褶白色，后粉红色梢密，宽，离生，不等长。菌柄圆柱形，长5-18cm，粗0.8-1.5cm，白色或带黄色，光滑，内实。菌托较大，杯状，厚，白色至灰黑色。 　　秋季在草堆上群生。我国南方多用稻草进行人工栽培。 　　分布于我国河北、福建、台湾、湖南、广西、四川、西藏等地。 　　可食用，肉脆嫩，味鲜美。可药用，其性寒、味甘，能消食去热，增进身体健康。 竹荪 羊肚菌 榆黄菇

培养基 生长因子非全部微生物所需 各营养要素间比例合适 培养基 碳源、氮源、无机盐、生长因子、水 是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的营养基质。 碳源、氮源、无机盐、生长因子、水 生长因子非全部微生物所需 各营养要素间比例合适

培养基 一、选用和设计培养基的原则 1.目的明确 培养不同的微生物必须采用不同的培养条件； 培养目的不同，原料的选择和配比不同；

培养基 2.营养协调 微生物细胞组成元素的调查或分析，是设计培养基时的重要参考依据。 （1）选择适宜的营养物质 实验室的常用培养基： 细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）； 放线菌：高氏1号合成培养基培养； 酵母菌：麦芽汁培养基； 霉菌： 查氏合成培养基；

培养基 （2）营养物质浓度及配比合适 营养物质的浓度适宜； 营养物质之间的配比适宜； 高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀菌作用。

培养基 3.理化适宜 指培养基的pH值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件较为适宜。 pH 渗透压和水活度 氧化还原电位

培养基 pH 各大类微生物都有其生长适宜的pH范围，培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。 细菌： pH 7.0~8.0 放线菌：pH 7.5~8.5 酵母菌： pH 3.8~6.0 霉菌：pH 4.0~5.8 藻类： pH 6.0~7.0 原生动物： pH 6.0~8.0 初始pH

培养基 4.灭菌处理 要获得微生物纯培养，必须避免杂菌污染，因此对所用器材及工作场所进行消毒与灭菌。对培养基而言，更是要进行严格的灭菌。对培养基一般采取高压蒸汽灭菌。在高压蒸汽灭菌过程中，长时间高温会使某些不耐热物质遭到破坏；长时间高温还会引起磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子(特别是钙、镁、铁离子)结合形成难溶性复合物而产生沉淀；高压蒸汽灭菌后，培养基pH会发生改变(一般使pH降低) 。

培养基 二、培养基的种类 培养基——微生物的菜谱 名目繁多、种类各异

培养基 （一）按对培养基成分的了解作分类 天然培养基 组合培养基 半组合培养基

培养基 （二）按培养基外观的物理状态作分类 液体培养基 固体培养基 半固体培养基 脱水培养基

培养基 （三）按培养基对微生物的功能作分类 基础培养基 加富培养基 增殖培养基 选择性培养基 鉴别性培养基

培养基 天然培养基 这是指一些利用动、植物或微生物体或其提取物制成的培养基，这是一类营养成分既复杂又丰富、难以说出其确切化学组成的培养基。 例如，培养多种细菌的牛肉膏蛋白胨培养基， 培养酵母菌的麦芽汁培养基等。

培养基 天然培养基的优点： 缺点： 营养丰富、种类多样、配制方便、价格低廉 。 是成分不清楚、不稳定，不适宜做精细的科学实验。 天然培养基只适合于一般实验室中的菌种培养、发酵工业中生产菌种的培养和某些发酵产物的生产等。

培养基 组合培养基 又称合成培养基或综合培养基（synthetic media），是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。 例如，培养细菌的葡萄糖铵盐培养基， 培养放线菌的淀粉硝酸盐培养基（即高氏一号培养基）， 培养真菌的蔗糖硝酸盐培养基（即察氏培养基）等。

组合培养基仅适用于营养、代谢、生理、生化、 组合培养基的优点： 成分精确、重演性高。 缺点： 价格较贵、配制较烦，且微生物生长比较一般。 组合培养基仅适用于营养、代谢、生理、生化、 遗传、育种、菌种鉴定或生物测定等 对定量要求较高的研究工作中。

培养基 液体培养基（liquid media） 一类呈液体状态的培养基，在实验室和生产实践中用途广泛，尤其适用于大规模的培养微生物。

培养基 固体培养基（solid media） 广义：一类外观呈固体状态的培养基。 狭义：在液体培养基中加入凝固剂，使之成为固体的培养基。 固体培养基为微生物生长提供一个营养表面，微生物在这表面上可以形成单个菌落。

半固体培养基（semi-solid media） 指在液体培养基中加入少量的凝固剂而配制成的半固体状态培养基， 例如，“稀琼脂”（sloppy agar），它在小型容器倒置时不会流出，但在剧烈震荡后则呈破散状态。

培养基 一般可在液体培养基中加入0.5％左右的琼脂制成。 半固体培养基可放入试管中形成“直立柱”，这在微生物学实验中有许多独特的用途， 例如，细菌的动力观察（在半固体直立柱中央进行细菌的穿刺接种，观察细菌的运动能力）， 微生物趋化性的研究， 厌氧菌的培养、分离和计数， 细菌和酵母菌的菌种保藏等。

培养基 固体培养基中凝固剂必须具有的特点： a. 不被微生物液化、分解和利用 b. 在微生物生长的范围内保持固体状态 c. 凝固点的温度对微生物无害 d. 不因消毒灭菌的高温处理而破坏 e. 配制方便、价格低廉 f. 透明度好、粘着力强

培养基 常用的凝固剂： 琼脂（agar）、 明胶（gelatin）、 海藻酸钠（alginate）、 脱乙酰吉兰糖胶（Gelrite）、 多聚醇F127（pluronic polyol F127 ）等。

培养基 基础培养基（minimum media） 在一定条件下含有某类微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基，也称为基本培养基。

加富培养基（enriched media） 在普通培养基（如肉汤蛋白胨培养基）中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物。 这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。

增殖培养基（complete media） 在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其他微生物，这种培养基称为增殖培养基。常用于菌种筛选。 要分离出能利用石蜡油进行发酵的酵母菌，只需在配方里使用石蜡油作碳源。

选择性培养基（selected media） 一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。 加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞

鉴别性培养基（differential media） 一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。 最常见的鉴别性培养基是伊红美蓝乳糖培养基。 它在饮用水、牛奶的大肠菌群等细菌学检查和在 E. coli 的遗传学研究工作中有着重要的用途。

培养基 三、培养基的配制 贮存 配料 摆斜面 溶解 灭菌 调pH 包扎 过滤 分装

菌落 菌落是指在固体培养基上（内）以母细胞为中心的一堆肉眼可见的，有一定形态、构造等特征的子细胞集团。 如果菌落是由一个单细胞繁殖形成的，则它就是一个纯种细胞群。 如果把大量分散的纯种细胞密集地接种在固体培养基的较大面积上，结果长出的大量“菌落”互相连成一片，这就是菌苔。

菌落 细菌的菌落特征因种而异！ 细菌菌落的特征 主要特征：一般呈现为湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。 细菌的菌落特征因种而异！

菌落

菌落

细 菌 酵 母 菌

无菌技术 无菌技术的概念：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。 日常的生活环境中，每时每刻每处都存在着微生物，任何一个不经意的动作都可能将某种微生物引入到培养物中。在具备无菌环境和获得无菌材料后，还要始终保持无菌状态，才能对某种特定的已知微生物进行研究或利用它们的功能，否则外界的各种微生物很容易混入。

无菌技术 外界不相干的微生物混入的现象，在微生物学叫做污染杂菌。防止污染是微生物学工作中十分关键的技术，彻底灭菌和防止污染是无菌技术的两个方面。 此外，要有效避免操作者自身被微生物感染，还要防止所研究的微生物，特别是致病微生物或经过基因工程改造了的本来自然界不存在的微生物从我们的实验容器中逃逸到外界环境中去（生物安全）。

无菌技术 消毒与灭菌的概念： （1）培养细菌用的培养基与培养皿（需要灭菌） （2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（需要灭菌） （3）实验操作者的双手（需要消毒） （4）接种环、针、涂布棒：灼烧灭菌（外焰）。

无菌技术 消毒：指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。 灭菌：指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。 超净工作台

无菌技术 消毒的方法： 1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min 3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线或化学药物消毒

无菌技术 灭菌的方法： 1、灼烧灭菌 2、干热灭菌：160-170 ℃ 下加热1-2h。 3、高压蒸汽灭菌：100kPa、 121 ℃下维持15-30min.

无菌技术

无菌技术 倒平板： （1）灭菌后，培养基冷却到55 ℃后应及时进行倒平板操作；每个72mm培养皿需要培养基12～15ml。 （2）为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

无菌技术 倒平板： （3）平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 （4）在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。

无菌技术 平板划线

无菌技术 平板划线 （1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的细菌，避免细菌污染环境和感染操作者。

无菌技术 平板划线 （2）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死细菌。 （3）在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

无菌技术 涂布平板： 应从操作的各个细节保证“无菌”，涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围，等等。

【例】 培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌、消毒方法依次是( ) 【例】 培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌、消毒方法依次是(　) ①化学消毒　②灼烧灭菌　③干热灭菌　④紫外线灭菌　⑤高压蒸汽灭菌　⑥巴氏消毒法 A．⑤③②①④⑥ B．①②③④⑤⑥ C．⑥②③④①⑤ D．③④②①⑥⑤ 答案　A

几种常用灭菌方法比较 方法 灭菌操作 适用对象 灼烧 灭菌 在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 对接种环、接种针或其他金属工具灭菌，也可以对试管口、瓶口灭菌 干热 在干热灭菌箱内，160～170 ℃条件下，加热1～2 h 耐高温且需保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等 高压 蒸汽 在高压蒸汽灭菌锅内，121 ℃，100 kPa，灭菌15～30 min 培养基、发酵设备等 紫外 线灭 菌 30 W照射30 min 小型接种室、接种箱等

本节课内容结束