EGFR基因突变检测 贾飞龙 技术支持 江苏 苏州 2015-08-27

目录 EGFR基因突变检测的临床应用 EGFR基因的检测现状 血液检测的基础 公司现有EGFR基因突变检测产品

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Time from randomisation (months) EGFR基因突变检测在临床应用的意义 吉非替尼等靶向药物疗效： EGFR基因突变型患者优于野生型患者 Gefitinib EGFR M+ (n=132) Gefitinib EGFR M- (n=91) Carboplatin / paclitaxel EGFR M+ (n=129) Carboplatin / paclitaxel EGFR M- (n=85) Gefitinib EGFR M+ (n=132) Gefitinib EGFR M- (n=91) Carboplatin / paclitaxel EGFR M+ (n=129) Carboplatin / paclitaxel EGFR M- (n=85) 4 8 12 16 20 24 Time from randomisation (months) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 无进展生存率 结论：1. 阳性效果好，阴性效果差，所以必须在用药前做检测。 患者 未接受过化疗 年龄 ≥18岁 腺癌 从未或曾少量吸烟者* 预期存活≥12周 PS 0-2分 可测量的IIIB / IV期疾病 IPASS: 根据突变状态的疗效分析 N Engl J Med 2009;361:947-57.

EGFR基因突变检测在临床应用的意义 EGFR基因突变优势人群：亚裔、女性、非吸烟、腺癌 非吸烟者 女性 亚裔 腺癌 非亚裔 男性 吸烟者 非腺癌 种族 性别 吸烟史 组织学 EGFR突变发生率： 回顾性数据 (N=2880)

EGFR基因突变检测在临床应用的意义 对象 有效率 不加选择的中国患者 30％ 根据临床特征选择优势人群 50％ 根据EGFR敏感基因选择 +耐药基因选择 70-80% 80-95% 检测项目 检测结果 临床意义 EGFR 无突变 患者对易瑞沙和特罗凯等靶向药物不敏感。 有突变 患者对易瑞沙和特罗凯等靶向药物敏感。

NCCN指南v.2.2009版：尚无关于EGFR突变患者一线治疗的推荐

NCCN指南v.2.2010版：EGFR突变患者首选特罗凯

EGFR基因突变位点 耐药突变 敏感突变

EGFR突变类型与吉非替尼治疗敏感性 组别 突变类型 所占比例 对吉非替尼敏感性 1 ~90% 敏感 2 ~7% 敏感，数据有限 3 ~3% Exon 19 deletions; L858R ~90% 敏感 2 T790M/deletions; T790M/L858R; G719X; L861Q; S768I ~7% 敏感，数据有限 3 T790M alone; Exon 20 insertions; other mutations ~3% 不敏感 Mok et al., 2008 Kim et al., 2008 Hirsch et al., 2006 AZ In-House Data - Unpublished

EGFR突变类型与吉非替尼治疗敏感性 时间从随机分组起计算 (月) 外显子19缺失突变 HR (95% CI) = 0.377 (0.255, 0.560) 吉非替尼组事件数, 46 (69.7%) C/P组事件数, 65 (87.8%) 吉非替尼 (n=66) 卡铂/紫杉醇 (n=74) 66 40 18 6 2 74 15 4 1 61 56 8 12 16 20 24 吉非替尼 C/P 无进展生存患者 : 月 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 无进展生存率 L858R HR (95% CI) = 0.553 (0.352, 0.868) 吉非替尼组事件数, 48 (75.0%) C/P组事件数, 40 (85.1%) 64 30 13 5 1 47 17 2 48 39 4 8 12 16 20 24 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 无进展生存率 吉非替尼 (n=64) 卡铂/紫杉醇 (n=47) 月 时间从随机分组起计算 (月) 含共变量的回顾性Cox分析 由于患者数少未计算P值 Post hoc Cox analysis with covariates; ITT population Mok et al 2009 12

EGFR突变检测的应用 EGFR突变检测的应用 很好预测TKI药物对NSCLC患者的疗效 外周血耐药突变检测 非小细胞肺癌 外显子19缺失； 外显子21点突变； 外显子18点突变； 肿瘤对TKI敏感，患者使用TKI治疗 外显子20未发生突变，继续使用TKI治疗 外显子20突变，提示TKI治疗产生耐药，转为非TKI治疗 没有发现外显子18、19、21突变 肿瘤对TKI不敏感，患者使用非TKI治疗

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截至2014年12月, 全国共有110家医院建立了院内EGFR基因突变检测平台 2011 2012 2013 2014 检测率 6% 14% 20% 27% 阳性率 30% 32% 33% 检测中心数 39 50 70 110 平均检测 时间(天) 10 7 6 2013年院内检测中心 2014年新建的院内检测中心 截至2014年12月, 全国共有110家医院建立了院内EGFR基因突变检测平台 Data form AstraZeneca China internal

送检率的省市差异 送检率 EGFR送检率也呈现出地域性差异, 一线城市送检率相对较高, 而偏远省市则较低; 全国整体呈增长的趋势, 原因为: 已有平台医院的送检率持续上升和新平台的建立; 检测入医保是推动送检率的加速剂, 成功案例: 广东、新疆. Data form AstraZeneca China internal 数据基于已有院内平台的送检情况

整体送检率与阳性率分析 整体送检率分析 整体阳性检率分析 医院数 62 40 8 医院数 41 28 28 目前我国仍有50%以上具有院内检测平台的医院送检率偏低, 可能是由于检测观念、医疗技术水平和科室配合度等因素导致的. 目前国内近40%的院内检测平台阳性率偏低.原因可能存在于实验室条件、标本病理分型、标本的取材与固定、标本的病理质控、检测方法的选择及操作技术等多个环节. Data form AstraZeneca China internal 数据基于已有院内平台的送检情况

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ctDNA(液态活检)—新一代肿瘤标志 ctDNA不仅可以诊断实体肿瘤，而且能够监测治疗反应以及探查微小残留病灶、靶向治疗耐药突变，可能是优选的无创肿瘤筛查方法。 —— 美国斯坦福大学Maximilian Diehn教授 ctDNA是一种具备广泛应用前景、高敏感性、高特异性的肿瘤标志物，适用多种不同的实体肿瘤。未来，广泛的成像和侵入性的组织活检将会被替代，液体活检可能被用于指导癌症治疗决策，以及用于可能尚未成像的肿瘤筛查。 —— 美国约翰霍普金斯大学Luis Diaz博士

ctDNA(Circulating Tumour DNA) cfDNA（cellfree DNA） 或者叫血浆游离DNA，是血浆中游离存在的 DNA。 来源：1、正常细胞；2、异常细胞（如肿瘤细 胞）；3、外部（如病 毒DNA）。 人们发现cfDNA中 携带肿瘤特有突变的那一小部分DNA，确确 实实是由肿瘤细胞释放出来的。 这种携带了突变信息的循环DNA是肿瘤的标志。 ctDNA（circulating tumour DNA） 来源：1、坏死的肿瘤细胞；2、凋亡的肿瘤细 胞；3、肿瘤细胞分泌的外排体。 突变类型：点突变（SNV），短的插入缺失（InDel），拷贝数 变异（CNV），结构变异（SV）等等。 发现过程：70年代Leon等研究表明癌症患者外周血清DNA水平 大大高于正常人。 1989年Stroun等发现血液游离DNA具有肿瘤细胞DNA的一些特征。 5年后研究者在肿瘤患者的血浆和血清中检测到癌基因的突变， 与原发瘤一致。

不同肿瘤和分期均可释放ctDNA 图1：不同癌症的ctDNA检出情况 图2：不同分期癌症的ctDNA检出情况 发现不同的癌症有较大的差异 脑肿瘤的检出率不到10%——这或许和不 同组织的特性，如血脑屏障有关 图1：不同癌症的ctDNA检出情况 在几乎所有种类的癌症中，都检测到了ctDNA所带有的标志性 突变 并且肿瘤越晚期，病情越严重，肿瘤的恶性程度越高， ctDNA 特有突变的频率就越高。 一项针对15种癌症进行的ctDNA测序研究显示，分别有47%， 55%，69%，82%的I-IV期癌症病人中能检测到高于一定频率的 ctDNA突变； 而另一项使用更高灵敏度测序技术的研究则表示，对于II期以 上的病人，均能100%检测到突变。 图2：不同分期癌症的ctDNA检出情况

ctDNA比单独一块肿瘤组织有更好的代表性 肿瘤是有异质性的 同一个肿瘤的不同部位基因组是有差异的 同一个病人的原发癌和转移癌基因组也是有差异的 ——但是它们将ctDNA释放进的是同一个血 液循 环系统 ——这也就意味着：ctDNA比单独一块肿瘤 组织有更好的代表性。 一个研究小组分析了一个有多处肿瘤的病人， 证实ctDNA确实来自于所有的肿瘤组织，甚 至有的还有可能来自于影像学观察不到的微 小癌肿。

ctDNA可以动态跟踪EGFR突变的变化 使用第一代TKI药物复发的NSCLC病人（N=124），血浆游离DNA中检测出T790M的中位时间是临床PD前的2.2个月。

会议近况 在中国，所有晚期非小细胞肺癌，不论腺癌还是非腺癌，均应进行EGFR 检测，然后进行后续治疗 2015年4月16日，瑞士日内瓦，第五届欧洲肺癌大会（ELCC） IGNITE研究：第一项在亚太地区及俄罗斯开展的国际多中心，非干预性，分子流行病学调查的临床研究，旨在观察真 实世界中，非小细胞肺癌患者（腺癌及非腺癌）的EGFR基因突变检测现状，包括EGFR基因突变发生率，不同标本类型组织与 血液的检测 差异，及真实世界中患者的一线临床治疗选择等等。 共计入组3382例，其中中国患者1458例。 有2581例同时拥有可进行EGFR基因突变检测的组织/细胞学标本和血液标本。 在中国，所有晚期非小细胞肺癌，不论腺癌还是非腺癌，均应进行EGFR 检测，然后进行后续治疗 亚太地区EGFR基因突变率：腺癌49.2%，非腺癌14.1%。 EGFR血浆ctDNA检测具有高度特异性，是组织细胞学检测的有效替代手 段 特异性：血液检测与组织学/细胞学检测相比，具有较高特异性，亚太地区患者中，特异性达 到97.2%。这说明对于血液检测的假阳性率低，通过血液检测出的EGFR基因突变阳性患者，可 认为是真正的EGFR基因突变阳性患者。 敏感性：血液检测与组织学/细胞学相比，其敏感性为49.6%

目录 EGFR基因突变检测的临床应用 EGFR基因的检测现状 血液检测的基础 公司现有EGFR基因突变检测产品

公司现有EGFR基因突变检测产品 项目 技术 适用样本 适用仪器 位点 特点 试剂盒 送检 Taqman-ARMS 组织 含FAM、HEX(VIC)通道的荧光定量PCR仪 20个位点 有注册证 qPCR-HRM 血液、组织 LightCycler 480 4个外显子(18/19/20/21)（+T790M） 灵敏度高 荧光PCR法 LightCycler 480等 29个位点 数字PCR 数字PCR仪 5个位点 （E746_A750del、G719S、T790M、L858R、L861Q） 灵敏度高，可定量 注意：Taqman-ARMS、荧光PCR法两种试剂盒使用前，请联系技术人员确认仪器是否满足要求

EGFR基因突变检测（荧光PCR法） 共计37例（数据更新：2015-08-26） HRM法：结果1例突变，突变 率2.7% 编号 样本类型 HRM法 荧光PCR法 1 血浆 野生 2 e21-突变 L858突变 3 4 5 6 L858R突变 7 8 9 10 L858R-突变 11 E19-DEL-突变 12 13 14 15 16 共计37例（数据更新：2015-08-26） HRM法：结果1例突变，突变 率2.7% 荧光PCR法：结果16例突变， 突变率43.2%

数字PCR—第三代PCR 第一代 终点PCR技术 通过凝胶电泳获得定性的结果 第二代 定量PCR技术 利用荧光试剂监控扩增，需参考基因或标准曲线来协助定量 第三代 数字PCR技术 不再需要参考基因或标准曲线，能够对起始样本进行绝对定量