肿瘤药物敏感实验

化疗的重要性 自1946年Gillman和Phillip报道氮芥类药物治疗造血系统肿瘤以来，化学治疗巳取得很大的进步。目前化学治疗已使绒癌、恶性淋巴瘤、睾丸精原细胞瘤、小细胞肺癌等多种恶性肿瘤获得治愈的机会，大多数恶性肿瘤能得到缓解，化疗在恶性肿瘤的治疗中具有不可替代的地位。

肿瘤化疗的局限性 肿瘤的化学治疗在半个世纪以来，虽然取得显著进展，但临床抗肿瘤药物治疗的总有效率并不高，阻碍化学治疗取得更好疗效的原因众多，主要包括：

1. 现行化疗的盲目性 抗肿瘤药物研究表明，即使是相同组织学类型的肿瘤对同一抗肿瘤药物的反应也并不尽一致，对不同脏器或不同组织学类型的肿瘤采用相同的用药方案，效果更是千差万别。目前大多数化疗是采用的对某种脏器既定的联合方案,仍有一定的盲目性。

2.化学治疗的抗药性 有些肿瘤对某些药物存在先天耐药,还有些肿瘤经化疗缓解，肿瘤敏感株杀灭，耐药株成为复发的根源，而且对以后的化疗抵抗。

3. 抗癌药物的毒性 所有抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤正常的组织细胞，尤其是增殖旺盛的骨髓造血细胞和胃肠道细胞。期望通过增大剂量、增加用药品种、缩短间隔时间的方法来提高抗癌效果，则将进一步加重毒性作用。

如何解决这些问题？ 肿瘤化疗个体化: 研究发现，根据药敏检测结果指导选药，有效率可在原来固定化疗方案的基础上提高一倍以上，于是提出了肿瘤化疗个体化的概念(即预见性化疗)。根据个体肿瘤敏感性检测的结果，选用敏感的药物的联合方案，无疑将会大大提高肿瘤的治疗水平。

肿瘤药敏的可行性 七十年代细胞培养技术的突破，新型培养材料、培养基的问世。 1983年Mosmann建立了MTT法，方法简便，设备要求不高，检测时间短，便于在临床上广泛开展。 新的抗癌药不断问世，同一种肿瘤有多种联合化疗方案可供选择。

肿瘤药敏的方法学 肿 瘤 细 胞 药 敏 裸鼠皮下移植 裸鼠肾包膜下移植 裸鼠原位移植 体内法 染料排斥法 集落形成法 同位素法 四唑蓝比色法 体外法

裸鼠肾包膜下移植 裸鼠肾包膜下移植实验是肿瘤细胞药敏体内实验最常用的方法，但由于裸鼠需要在无菌条件下饲养，而且肾包膜下移植实验操作复杂，实验周期长，不易在临床广泛开展。

染料排斥实验 原理是细胞死亡后膜通透性增加，染料通过细胞膜而使细胞着色，故通过计数未着色细胞可计算出药物的杀伤率。但由于某些受杀伤尚未死亡的细胞也不易着色，故假阴性率较高。另外在计数时主观的因素会出现较大的误差，目前较少应用。

集落形成法 集落法(Human Tumor Cell Cloning Assay, HTCA）肿瘤组织由增殖和非增殖细胞组成，其中仅有 1％具有旺盛的增殖能力，是肿瘤浸润扩散和复发的根源。 这种细胞具有形成细胞集落的能力,故又称为肿瘤干细胞。 测定肿瘤干细胞对药物的敏感性符合临床药物治疗的需要。

集落形成法方法学 玻璃毛细管法: 培养基0.6ml，瘤细胞悬液0.1ml,抗癌药0.1 ml, 1％琼脂糖0.2ml加在一起混匀后向玻璃毛细管内加入50μl，冷却凝固后置37℃二氧化碳培养箱内培养。 双层琼酯法：底层加入0.5% 的琼脂培养液, 上层加含肿瘤细胞悬液的0.3 % 琼脂培养液。上层培养液供肿瘤细胞生长，下层防止细胞贴壁及成纤维细胞的过度生长。

集落形成法的优点 抑制纤维母细胞的增殖，不受肿瘤细胞以外的细胞的影响。 下层滋养层可加入各种辅助分子，更利于肿瘤的生长。 直接测定药物对肿瘤细胞中最活跃的成分肿瘤干细胞的影响。

集落形成法的缺点 高纯度单细胞悬液的制备困难。 所形成的细胞集落并非都是肿瘤细胞集落。 成功率低，有一定的难度。 培养周期长，需10天左右。

放射同位素法 3H的β射线能量低，分辨率高，半衰期长达 12年,3H标记胸腺嘧啶核苷(3HTdR)为最常用。 放射性同位素标记的核苷酸容易掺入DNA和RNA分子中 放射性同位素发灵敏度高，重复性好。 时间短，可较快地得到结果。 仪器设备要求高。 由于具有放射性，故操作时需要一定的防护措施。 废料需特别处理。

3HTdR掺入法 用培养液调整细胞浓度为1×105/ml。将此浓度的细胞接种于微量培养板，每孔100μl，每3孔为一组，加入100μl含有化疗药的培养基，培养52小时，加入20μl 3HTdR,实验结束后，吸弃上清，加入0.3％胰蛋白酶消化细胞，用多头细胞收集器收集细胞。最后用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数（CPM）值。

四唑蓝比色法（MTT法） 原理：活细胞内线粒体脱氢酶能将四甲基偶氮唑盐转化为蓝紫色结晶物(formazan)，用二甲亚砜（DMSO）溶解后，可在酶标仪上记录吸光度。 优点:1.操作简便，设备要求不高，时间短。 2.实验精确，重复性好，而且无主观人为 因素影响，临床符合率85％。 3.成功率高，约为80－90％

MTT法操作方法 用培养液调整细胞浓度为1×105/ml后接种于微量培养板，每孔100，每组设三个平行孔，加入100μl 含有化疗药的培养基,置培养箱内培养68小时，加入20μl MTT后再培养4小时,吸弃上清，每孔加二甲亚砜200μl,用微量震荡器震荡,使结晶产物充分溶解，在自动酶标仪上比色，测出波长570nm处的吸光度，最后计算细胞杀伤活性。

MTT法注意事项 血供丰富的肿瘤组织在制取肿瘤单细胞悬液时，大量的红细胞影响测定，可用红细胞裂解液裂解红细胞。 有色的抗癌药物对吸光度有影响，可用同浓度的药物作为本底，去除药物的影响。 吸弃上清时要注意不要吸掉结晶物，一般要先离心，板底留约30μl的培养基

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