大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化

实验目的 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。

原理 感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经过42℃短时间的热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。转化效率为106 ～107转化子/µg DNA。

受体细胞： 也称宿主，是重组子扩增及表达的场所，分为原核细胞和真核细胞两类。 原核细胞主要是大肠杆菌、链霉菌及枯草杆菌等（原核细胞不但是重组子复制扩增的场所，也可以作为外源基因的表达系统）。 真核细胞包括酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞等。

宿主细胞是基因克隆载体的增殖场所，对于一个适当的宿主细胞，具有以下几个要求： ①对重组子的复制和扩增没有严格的限制； ②不存在特异的内切酶体系降解重组子； ③在重组子增殖过程中，不对载体DNA进行修饰； ④不会产生载体DNA的体内重组； ⑤容易导入重组子； ⑥符合“重组DNA操作规则”的安全标准。

重组子导入受体细胞： 转化(transformation or introduction)：特指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 转染(transfection)：是指噬菌体、病毒或以它作为载体构建的重组子导入细胞的过程。

克隆的筛选： 主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；

将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。 如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。 虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。

实验仪器 1 ．超净工作台 2 ．低温离心机 3 ．恒温摇床 4 ．恒温培养箱 5 ．-70 ℃ 冰箱 6 ．移液器 10ul 、100ul 、1000ul

材料和试剂 菌株：E.coli DH5α 质粒：PET28a+AKP片段的质粒以及PET28a空质粒； LB培养基；含抗菌素的LB平板培养基（卡那霉素，浓度50µg／mL）； 预冷CaCl2溶液（0.1mol／L）

1）CaCl2感受态细胞的制备 1、挑取DH5单菌落于LB培养基中,37℃摇床培养过夜（约16小时）； 2、取1ml菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）(OD600nm 0.3～0.5 ) ； 3、将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作； 4、吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5、4℃下4000rpm离心10分钟； 6、弃上清，倒置离心管1分钟，流尽剩余液体，加入200l预冷0.1MCaCl2溶液，移液枪轻轻吹打均匀，使细胞重新悬浮，在冰上放置10分钟； 7、4℃下4000rpm离心10分钟； 8、弃上清，加入100l预冷0.1MCaCl2，轻轻吹打均匀，使细胞重新悬浮； 9、细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

2）细胞转化 分别取3个100µl感受态细胞悬液，第一组，加入10 µl重组质粒DNA+100µl感受态细胞，此管为转化实验组。第二组，阴性对照组，即2µl双蒸水+100µl感受态细胞悬液；第三组，阳性（质粒DNA）对照组，即1µl未酶切PET28a质粒DNA十100µl感受态细胞悬液。 (2) 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温45s-1min，然后迅速冰上冷却2min。 (3) 立即向上述管中分别加入0.8ml LB液体培养基（不需在冰上操作），摇匀后于37℃振荡培养约1h，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。

3) 平板培养（有时需要稀释） （1）取各样品培养液0.2ml，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。 （2）菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养。

各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析 组别 含抗菌素的平板 结果说明 转化实验组 少量菌落 说明有重组质粒导入细胞中（还需要酶切进一步鉴定） 阴性对照组 无菌落 无抗性菌的污染 质粒对照组 大量菌落 可以判断感受态细胞的效率

注意事项 1.细菌的生长状态：密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞。 2.所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 3.经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降 4.化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子(如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； 5.所使用的器皿必须干净。去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； 6.质粒构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA； 7.一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比； （一般通过检测OD600来控制。DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）； （这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；

重组DNA转化细菌过程示意图