实验 芦丁的鉴定 实验目的 实验内容 思考题

实验目的 掌握黄酮类成分的主要性质及黄酮苷、苷元和糖部分的鉴定方法

实验内容 一、化学检识 取芦丁3~ 4mg，用无水乙醇5~ 6ml溶解，分成3份做以下试验。 注意观察颜色变化情况 （2）取上述溶液1~ 2ml，加 2%ZrOCl2 的甲醇溶液，注意观察颜色变 化情况，再继续向试管中加入2%柠檬的甲醇溶液，并详细记录 颜色变化情况 （3）α-茶酚反应（Molishs Reacfion） 取上述溶液1~ 2ml，然后加10%α-茶酚乙醇溶液，摇匀，沿 管壁滴加浓硫酸，注意观察两液面产生的颜色变化

二．纸色谱及薄层色谱鉴别 1. 纸色谱： 新化一号层析滤纸 样 品: 自制芦丁、槲皮素 对照品: 芦丁、槲皮素 样 品: 自制芦丁、槲皮素 对照品: 芦丁、槲皮素 展开剂: (1) 正丁醇-醋酸-水（4:1:5上层或4:1:1） (2) 25%醋酸水溶液 (3) 85%醋酸水溶液 显 色: (1) 可见光下观察，再在紫外光下观察 (2) 经氨气后再观察 (3) 喷三氧化铝试剂后再观察

2 .芦丁和槲皮素的聚酰胺薄层色谱鉴定： 新化一号层析滤纸 样 品: 自制芦丁、槲皮素 对照品: 芦丁、槲皮素 展开剂: 乙醇-水（7:3） 样 品: 自制芦丁、槲皮素 对照品: 芦丁、槲皮素 展开剂: 乙醇-水（7:3） 显 色: （1）可见光下观察，再在紫外光下观察 （2）经氨气后再观察 （3）喷三氧化铝试剂后再观察

3 .糖的检出一纸色谱析法： 取上述滤除槲皮素时保留的水解滤液20ml加Ba(OH)2的细粉（约2.6克）中和至PH7。滤除生成的BaSO4沉淀（可用滑石粉助滤）。滤液浓缩至约1ml。供纸层析点样用。 展开剂 正丁醇-醋酸-水（4:1:5上层或4:1:1） 对照品 葡萄糖、水解液鼠李糖水溶液 显色剂 苯胺邻苯二甲酸盐试剂喷后，105℃烘十分 钟。显棕色或红色斑点。

三、槲皮素五甲醚的制备 取槲皮素结晶4000mg，置于150ml的三颈瓶中，加50ml无水丙酮，装上电动搅拌器，冷凝管及温度计，加热回流搅拌，每间隔一适当时间加入无水碳酸钾0.2克和硫酸二甲酯0.2ml，大约在1.5小时左右加完4克无水碳酸二甲酯，继续加热回流搅拌直至溶液黄色完全消退为止，约需4~5小时，停止加热，取下烧瓶，反应液经过滤，沉淀用热丙酮洗涤数次，合并洗、滤液、蒸馏回收部分丙酮，留存10 ~ 15ml，放置，渐渐析出无色结晶，母液浓缩，复得一批结晶，如母液浓缩后呈糖浆状不能析出结晶，应加5%NaOH数滴，振摇使硫酸二甲酯水解，此时又可析出一小部份结晶，合并，以乙醇重结晶, 得皮槲素五甲醚(mp152 ~ 153℃)

对照品：原儿茶酸（Protocatechuic acid） 间苯三酚（Phloroglucinol）。 四、槲皮素的降解 取槲皮素50mg，置于圆底烧瓶中，加水5ml，乙醇6ml，KOH2g，置水浴上加热回流10小时，蒸去乙醇，加水50ml溶解，用浓盐酸酸化至pH 2 ~ 3，用乙醚萃取三次，合并乙醚液，回收乙醚，供薄层层析点伴用。 五、槲皮素降解产物的薄层色谱 硅胶-CMC-Na薄层 对照品：原儿茶酸（Protocatechuic acid） 间苯三酚（Phloroglucinol）。 展开剂：氯仿-丙酮-醋酸（8:2:0.5） 显色剂：三氧化铁试剂

六、紫外吸收光谱测定槲皮素 （一）原理 （二）试剂 利用紫外吸收光谱，测定黄酮化合物在加入各种电解质或络合剂后吸收峰的位移，根据位移的情况，以判断该化合物羟基的位置 （二）试剂 无水甲醇 甲醇钠溶液 氢氧化钠溶液 三氯化铝溶液 醋酸钠 硼酸饱和液

（三）测定方法 （1）黄酮光谱：取样品溶液约3ml，在200~500nm波段内进行扫描。 1．黄酮羟基位置的测定： 精密称取黄酮样品（槲皮素）约1.2mg，用无水甲醇溶解，再稀释至100ml （1）黄酮光谱：取样品溶液约3ml，在200~500nm波段内进行扫描。 （2）氢氧化钠光谱：取样品溶液约3ml，加入氢氧化钠溶液2~3滴立即测 定。放置5分钟后，再测定。 （3）甲醇钠光谱：取样品溶液约3ml，加入甲醇钠溶液5~7滴后，立即进 行测定，放置5分钟后，测定。 （4）三氯化铝光谱：在盛有约3ml样品溶液的石英杯中，加入三氯化铝 溶液6滴，放置一分钟后进行测定，测定后，加入3 滴盐酸溶液（浓盐酸：水=1:1），测定。 （5）醋酸钠光谱：取样品溶液约3ml，加入过量的无水醋酸钠固体，摇 匀：杯底剩有约2mm的醋酸钠后，三分钟内进行测定

（四）测定结果 槲皮素加位移试剂结果表（λnm） 克分子吸收系数的测定：根据已测定的黄酮光谱，测量吸收峰的波长和吸收峰前后20nm的波长范围。然后取样品溶液约3ml，置于1cm长的石英杯中，测UV，仔细测量在上述波长范围内各波长的吸收值，反复测定三次。 加入试剂 编号 II峰 I峰 位移值 羟基位置 无水甲醇 1 256 371 NaOH 2 430 I峰△59 4’-OH NaOH5’ 2’ 分解 3，4’-OH MeONa 3 416 I峰△45 3-OH MeONa5 3’ AlCI3 4 270 450 I峰△79 3，5及3’,4’-OH AICI3/HCI 4’ 265 425 I峰△54 3’，4’-OH NaOAC 5 277 387 II峰△21 7-OH NaOAC/H3BO3 259 385 I峰△14 3’，4-OH

思考题及记录 思考题： （1）芦丁和槲皮素用不同展开剂系统展层将出现什么结果？为什么？ （2）芦丁和槲皮素聚酰胺薄层色谱将出现什么结果？为什么？ 记录： （1）芦丁和槲皮素的纸色谱、聚酰胺薄层色谱结果。 （2）糖的检出纸色谱结果。 （1）位移测定的结果 （2）测定克分子吸收系数、在吸收峰前后20nm波长范围内，依次测定波长和吸收值，用方格纸作图，精确的测出吸收峰的波长和吸收值，记录测定结果。