病原生物学实验课件 病原生物教研室制作

实 验 一 1、实验目的和要求 2、实验室规则 3、消毒与灭菌 4、介绍常用灭菌器材 5、常用仪器的使用 6、油浸镜的原理、使用、保护 7、紫外线杀菌试验 8、自然界细菌的分布 9、细菌的培养 10、细菌的生化反应

实验目的和要求 一、实验目的 (1)掌握病原生物学的基本实验方法和操作技术。 (2)通过实验设计的讨论和结果分析，培养学生的科学思 维方法，提高其独立工作的能力。 二、实验要求 (1)每次实验前，必须做好预习，明确实验目的、原理、方 法及操作中的注意事项等，避免和减少错误操作。 (2)实验过程中，必须持严肃认真的态度。 (3)对实验现象和结果必须进行仔细的观察和认真的记录， 然后进行科学分析，得出恰当的结论。 (4)实验报告要独立认真地完成，书写实验报告要字迹清楚、 语言简练、表格清晰，画图应力求反映实际标本的原状。 (5)切实遵守实验室规则。

实验室规则 (1)上实验课时，先到更衣室把个人的书包和衣物放到衣柜内，穿好实验服。随身只许携带必须的教材、笔记本、文具等，但要置于远离操作部位的位置。 (2)实验室要保持正常的工作秩序，不得高声谈笑和走动。 (3)实验室内禁止饮食和吸烟，不得用嘴舔湿铅笔或标签等。 (4)实验用过的带有传染性物质的吸管、玻片等应放在指定的消毒筒内，待消毒或废弃的物品必须放在指定地点。 (5)如发现有传染性的材料污染地面、桌面、书和衣物等时，应立即报告老师，以便及时处置。

(6)如将活菌碰到手上，应将手浸入来苏水中5-10min，然后用自来水冲洗；如将痰液吸人口内，应立即吐出，再用质量分数为0．1％的高锰酸钾漱口，必要时服用有关药物。 (7)注意节约实验试剂，爱护实验器材。器材损坏时，应立即报告老师，听候处理。 (8)易燃物品(酒精、二甲苯等)不准接近火源。一旦起火，应立即用沾水的布或沙土覆盖扑火。 (9)实验结束后，将实验台整理好，值日同学打扫室内卫生，并检查水、电等开关是否关好，防止发生事故。 (10)实验结束后，到更衣室脱下实验服，将实验服放人衣柜内，洗手消毒后离去。

消毒与灭菌 原理：微生物由蛋白质、核酸、脂类等构成，极易受外界条件的影响，对多种物理、化学因素都敏感。消毒与灭菌就是根据这一原理抑制或杀死外环境中的病原微生物。

消毒(disinfetion) 杀死物体上病原微生物的方法，并不一定能杀死含芽胞的细菌和非病原微生物。用以消毒的药品称为消毒剂(disinfectant)。一般消毒剂在常用的浓度下，只对细菌的繁殖体有效，对其芽胞则需要提高消毒剂的浓度和延长作用的时间。 灭菌(sterilization) 杀灭物体上所有微生物的方法。因此，灭菌比消毒要求高，包括杀灭病原微生物和非病原微生物、细菌的繁殖体和芽胞。

防腐(antisepsis)防止或抑制细菌生长繁殖的方法，细菌一般不死亡。同一种化学药品在高浓度时为消毒剂，低浓度时为防腐剂。 无菌(asepsis) 不含活菌的意思。防止细菌进入人体或其它物品的操作技术，称为无菌操作。

一、物理消毒灭菌法 （一）热力灭菌法 干热灭菌法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。原理 加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细 胞含水量越大，凝固越快。 （1）焚烧：被污染的纸张、实验 室有传染性的动物 尸体、无经济价值的物品可以烧掉。 （2）烧灼：火焰灼烧适用于接种环、 接种针和金属 用具如镊子等，试管口和瓶口，涂 布用玻璃棒。

（3）干烤：干烤灭菌法需在干烤箱进行，靠热空气进行灭菌。这种方法适用于玻璃器皿、金属器械以及不能遇水的油脂、凡士林等灭菌。灭菌时一般加热至160～170℃2小时可达到灭菌的目的。在装满物品的干烤箱内，不同部位的温度差可达30～40℃，故温箱内最好装有鼓风机使温度均匀。 箱内物品不宜装得太多，以免影 响空气的流通。 （4）红外线：红外线烤箱，供小 件器械(镊子、剪刀等)以及玻璃 注射器等迅速灭菌用。

注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品 不能用此法； 2）温度控制在<180°； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70°时才开箱门。

2. 湿热灭菌法: 原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固。蛋白质凝固时所需温度与其含水量成反比关系，即蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。湿热的穿透力比干热大。试验证明将100层的布卷，如用130～140℃干热，加热4小时，布卷第20层的温度只有86℃，第100层的温度不到70℃，而用105℃的湿热，加热3小时布卷第20层到100层的温度都是101℃。所以效果比同温度下干热好。

（1）巴氏消毒法(pasteurization)：常用于牛奶和酒类等物品的消毒。具体的消毒方法有两种：一是以61. 1～62 (2)煮沸消毒法：煮沸5分钟，可杀灭所有的细菌繁殖体。但杀死芽胞则需一至数小时。如在水中加入1%碳酸钠即可提高沸点，增强杀灭芽胞作用，同时又可防止金属器械生锈。如水中加2～5%石炭酸，则10～15分钟后可破坏芽胞，所以许多医疗器械如手术刀、剪、镊子、胶管、注射器等，常用煮沸消毒。

(3)流通蒸气消毒法：用阿诺氏灭菌器或普通蒸气笼进行。因此在正常大气压下，故温度不会超过100℃。普通细菌的繁殖体15～30分钟可杀死。但芽胞不易消灭。 (4)间歇灭菌法：有些物质不能加热至100℃以上，例如含血清的培养基等，为了消灭其中的细菌芽胞，须用间歇灭菌法。方法是用阿诺灭菌器或用蒸笼加热100℃维持30分钟，每天进行一次，连续三天。第一次加热后，细菌的繁殖体即被杀灭，而芽胞还能存活，为了使芽胞发芽成繁殖体，将被灭菌的物品取出放在室温37℃温箱内过夜，第二天再加热一次，则可杀死由芽胞生成的繁殖体。为了达到彻底灭菌，照上法再进行第三次加热，这样所有的芽胞将被杀灭。应用间歇灭菌法，在间歇期必须提供芽胞发芽所需条件。

(5)高压蒸气灭菌法 设备：高压灭菌锅 时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。 适用于培养基等的灭菌，在1. 05kg/cm2蒸气压下，温度达121.3℃，维持15～20分钟，可杀灭包括细菌芽胞在内的所有微生物。高压蒸气灭菌器就是根据这一原理制成的，常用于一般培养基、生理盐水、手术敷料、工作服、橡胶物品等耐高温、耐湿热等物品的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。

杀灭几类主要微生物的湿热条件 微生物 营养细胞 孢子或芽孢 酵母菌 50-60℃，5分钟 70-80℃，5分钟 霉菌 62℃，30分钟 杀灭几类主要微生物的湿热条件　 微生物 营养细胞 孢子或芽孢 酵母菌 50-60℃，5分钟 70-80℃，5分钟 霉菌 62℃，30分钟 80℃，30分钟 细菌 （中温细菌） 50-70℃，10分钟 2-800分钟，100℃；或 120℃，05-12分 病毒 60℃，30分钟　

(二)电磁波辐射杀菌法 1. 紫外线： 原理：紫外线波长在200－300nm，具有杀菌作用，以265-266杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；这与DNA的吸收光谱范围一致。紫外线主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻的二个胸腺嘧啶共价结合而形成双聚体，因而改变DNA的分子构型，干扰DNA的复制与转录，导致细菌的 死亡或变异。可产生臭氧和过氧化氢。杀 菌效力与强度和时间的乘积成正比。 缺点：穿透力不大。距照射物<1.2m为宜。 紫外线释放的能量较低，故穿透力较弱， 普通玻璃、纸张、尘埃、水蒸气等均能阻挡紫外线。

应用：只能用于手术室、传染病房、细菌实验室的空气消毒，或用于不耐热物品的表面消毒。 注意事项：杀菌波长的紫外线对人体皮肤、眼睛 有损伤作用，使用时应注意防护。 2. 电离辐射：包括高速电子、X射线和γ射线等。 在足够剂量时，对各种细菌均有致死作用。其机制 在于产生游离基，破坏DNA。电离辐射常用于大量 一次性医用塑料制品的消毒，亦可用于食品的消毒， 而不破坏其营养成分。

(三)滤过除菌法：是用物理阻留的方法将液体或空气中的细菌除去。所用的器具是滤菌器(filter)。滤菌器含有微细小孔，只允许液体或气体通过，而大于其孔经的细菌等颗粒不能通过。 滤过除菌主要用于一些不耐高温灭菌的血清、毒素、抗生素，以及空气等的除菌。 目前过滤除菌采用两类器具，一类叫深层滤器，例如用烧结玻璃、不上釉的陶瓷颗粒或石棉压成的滤板等：另一类是滤膜。深层滤器已经使用了100年以上，现在有逐渐被滤膜取代的趋势，但因为大量沉淀物容易堵塞滤膜，所以一般先用深层滤器除去大的颗粒。 滤膜一般由醋酸纤维素、硝酸纤维素、多聚碳酸酯、聚偏氟乙烯等合成纤维材料制成。滤膜的孔径一般为0.2微米，它可以滤除绝大多数微生物的营养细胞。过滤法的最大缺点是不能滤除病毒。

注意事项：1、压力适当； 2、无菌条件下进行； 3、防止渗透现象。 我们来看一下滤膜灭菌是如何工作的。如左图所示，在一个漏斗形容器上部放置数片滤膜。右图是整个过滤系统。待除菌的液体装在三角瓶中（1），用蠕动泵（2）将液体抽到过滤器（3）内，滤过的液体进入事先灭菌的瓶子中。　　

如果是灭菌少量液体，可以采用一种简单的的滤器。 过滤法用途广泛，除在饮料、药物生产中使用外，空气也常常用过滤法除菌。我们通常做微生物学实验时灭过菌的容器一般用棉花塞堵在出口处，实际上就是过滤除去空气中的微生物，使进入容器的空气中没有微生物污染。微生物学实验室使用的超净台也是用过滤法除菌。

(四)超声波杀菌 (五)干燥与低温：干燥能引起细菌蛋白质的变性和盐类的浓缩，妨碍细菌的生长或导致死亡。细菌的种类对干燥的抵抗力差异很大。浓缩的盐溶液或糖溶液可使细菌脱水而停止生命活动，根据这些原理，干燥方法可保存食品。  低温可以杀死细菌，特别是反复冻融时更易破坏细菌细胞的生命。这是由于冰冻过程中细菌胞内水分被胞外冰冻结晶吸收造成电解质浓缩和菌体蛋白变性，胞壁受损使胞内有机物(包括核酸、肽类等)随之漏出，致使细菌死亡。 实际工作中低温（4～8℃）应用于保存菌种或标本。目前保存菌种较好的方法是真空冷冻干燥法。将细菌迅速冷冻干燥可维持生命数年之久，而不致改变其毒力及抗原性。此方法可保存菌种、毒种和生物制品 。

二、化学消毒灭菌法 原理：应用化学制剂破坏细菌代谢机能。杀菌剂 如重金属离子；抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。 注意：与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类以 及微生物所处的环境有关。 常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、石碳酸 、福尔马 林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等

常用消毒剂种类 类别 作用机制 常用种类 酚类 蛋白变性，细胞膜损伤 石炭酸 醇类 蛋白变性 乙醇 氧化剂 氧化、蛋白沉淀 高锰酸甲 重金属盐 氧化、蛋白酶变性 红汞、硫柳汞 过氧乙酸、碘酒 表面活性剂 新洁而灭 染料 干扰氧化、抑制繁殖 龙胆紫

各种消毒剂的应用 1. 酚类 （1）石炭酸：2%～5% ，用于器械、排泄物消毒。 （2）来苏儿3%～5%，用于器械、排泄物、家俱、地面消毒；1%～2%用于手、皮肤消毒。 （3）洗必泰：0.01 %～ 0.05%，用于术前洗手，阴道冲洗等。 2. 醇类 酒精：70%～75%，用于皮肤、体温计消毒，不适用于伤口、粘膜。 3. 氧化剂 （1）高锰酸钾：0.1% ，用于皮肤粘膜、水果、蔬菜、餐具等消毒。 （2）过氧化氢：3%，用于皮肤创伤、化脓性炎症、厌氧菌感染消毒。 （3）过氧乙酸：0.2%～0.5%，用于塑料、玻璃、人造纤维消毒，皮肤消毒(洗手)。

（4）碘伏：2%～5%，用于皮肤消毒。 （5）氯：0.2～0.5ppm，用于饮水和游泳池水的消毒。 （6）漂白粉：10%～20%，用于排泄物、地面、厕所消毒，饮水消毒。 4. 重金属盐类 （1）硝酸银：1%，用于新生儿滴眼，预防淋球菌感染。 （2）红汞：2%，用于皮肤、粘膜和小创伤消毒 5. 表面活性剂 （1）新洁尔灭：0.1%，用于手术器械消毒、外科手术洗手；0.01%～0.05% 用于粘膜及深部伤口感染消毒。 （2）消毒净：0.1%，用于手术器械消毒、外科手术洗手。 6. 烷化剂 甲醛：10%，用于浸泡、物品表面消毒、蒸气消毒。 7. 染料及酸碱类。

影响消毒作用的因素 1.消毒剂的浓度和作用时间 2.环境有机物的存在 3.细菌的种类 4.温度 5. pH值

介绍常用灭菌器材 1、手提式高压蒸汽灭菌器 凡耐高温的普通培养基、药品、手术器械、外科敷料等，均可用此法灭菌。为保证灭菌效果和安全，器内要加入足量的水，装入的物品不要过挤，冷空气必须排尽，注意压力表的工作情况，防止压力表失灵而造成事故

使用方法： (1)先将筒内注水，然后把要灭菌的物品装入内筒，再把盖拧紧，打开排气阀门，开始加热。 (2)水沸腾后，排气阀门开始排出气体，待筒内气体全部排出后，关闭排气阀门。 (3)筒内压力达到要求时，调节热源，维持103．4kPa、121℃，20-30min，即可达到灭菌的目的。 (4)关闭热源，自然放凉，待压力表指针下降到零时，方可开盖取物。

注意事项： 1）冷空气彻底排除； ）加水； 3）压力降为“0”时方可打开。 在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表

干热湿热穿透力及灭菌效果比较 透过布层的温度/℃ 20层 10层 100层 干热130－140 4 86 72 70.5 不完全 湿热105.3 3 101 完全

2、干烤箱 干烤箱是用两层金属板制成的方形箱，中间充满石棉，箱底有热源(电炉)，并附有温度计和自动温度调节器。灭菌时，打开通气口，加热到80℃时，关闭通气口，待温度上升 到160-170℃时，保持2h。最高温度 不得超过180℃，超过180℃棉塞和 包装纸会被烤焦。灭菌后，待温度 下降40℃以下，再开箱取物。否则，冷空气突然进入，玻璃器材会炸裂。

耐高温的玻璃器材、瓷器等常用此法灭菌，如培养细菌用的试管、平皿、吸管等。经清洗和晾干后，烧瓶和试管口要塞上棉塞，平皿和吸管要放入特制的筒内或用纸包好后再行灭菌，以使灭菌后的器材保持无菌状态。

油浸镜的原理、使用、保护 显微镜的使用方法 显微镜是医学实验中常用的仪器，尤其对作为形态学科的病原生物学来说，显微镜更是必不可少的仪器之一。所以要求医学类专业的学生必须熟练掌握显微镜的使用方法，特别是油浸镜的使用方法。

一、普通光镜的基本结构 无论其外观形状如何，它都由两部分构成，即机械部分和光学部分。机械部分包括镜座、镜臂、载物台及台上的标本推进器、镜筒、物镜转换盘以及升降调节器等，其主要作用是支撑、固定镜头，调节物像焦距，搁置和移动标本。光学系统包括反光镜、聚光器，物镜和目镜。它的作用是收集光源并聚集于标本上，然后通过透镜放大成像映于眼帘，使肉眼本不能分辨的物体得以清楚观察。

光学系统是光学显微镜的核心部分，而物镜有又是其中最重要的部件。一般的光镜配有3～4个物镜（4倍、10倍、40倍、和100倍），标本的放大主要靠物镜。为了使用方便，常用红、黄、蓝、白的色圈分别标记物镜倍数。另外，在镜头上还刻有一些符号和数值来表示放大倍数、镜口率、镜筒长度、盖玻片厚度等。

二、普通光镜的使用方法 使用方法： ①双手托持显微镜，轻拿轻放。 ②检查显微镜有无问题，如发现问题，立即向任课教师报告。 ③调光。检查未染色标本时，以弱光线为宜，此时可将集光撂下降或缩小光栅。检查染色标本时，以强光线为宜，此时应适当升高集光器或将光栅打开。自然光源用平面反光镜，人工光源用囚面反光镜。

④标本观察。将标本置于载物台上，先用低倍镜观察。用粗调节器调出物像后，再用细调节器调出清晰物像。在换高倍镜观察时，由于高倍镜视野范围比低倍镜小，故须先将观察内容移至视野中央后再换之。有时显微镜存在偏心现象，此时要记住其偏心的方向和距离。寄生虫标本绝大多数为封片标本，有一定厚度，因此在观察时应不断调节细调节器。

三、油浸镜的原理、使用、保护 原理：显微镜的放大倍数与玻璃透镜的大小有关。油镜的透镜小，镜孔也小，观察时由于聚光器聚集的光源要通过载玻片、空气，才能进入物镜中。玻璃与空气的折光率不同，会产生折射，使一部分光线失掉，进入物镜的光线减少，致使观察视野暗淡，物像不清。如果使用折射率与玻璃相近的油介质，即可减少折射，增加视野亮度，提高分辨率。物镜干燥系(A)与油浸系(B)的光线能通路如图0．2所示。

油镜头使用原理

使用： 油浸镜观察。应先将集光器升至最高，光栅增至最大。转开物镜镜头，在玻片上加一滴镜油，再转换油镜头。眼从侧方看，调节粗调节器，使镜头浸入镜油中，以轻轻接触玻片为止(注意勿压碎玻片)。眼看目镜，调节粗调节器缓慢下降载物台，看到物像，立即停止，改用细调节器调出清晰物像。观察结束后，应用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭油镜头，再用于擦镜纸擦去残存二甲苯。下降集光器，竖起反光镜，将物镜镜头摆成“人”字型，对号送入镜盒内。

保护： 细调节器是显微镜最精细、最脆弱的机械部分，只能做有限的旋转。当旋转中遇到阻力，表明已达到极限，应立即返回。病原学标本及血涂片标本必须按一定顺序，逐个检查，以免遗漏。

紫外线杀菌试验（示教） 波长200～300nm的紫外线具有杀菌作用，其中以265～266nm最强，这与DNA的吸收光谱范围一致。紫外线主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻的二个胸腺嘧啶共价结合而形成双聚体，因而改变DNA的分子构型，干扰DNA的复制与转录，导致细菌的死亡或变异。 紫外线释放的能量较低，故穿透力较弱，普通玻璃、纸张、尘埃、水蒸气等均能阻挡紫外线，故只能用于手术室、传染病房、细菌实验室的空气消毒，或用于不耐热物品的表面消毒。杀菌波长的紫外线对人体皮肤、眼睛有损伤作用，使用时应注意防护。

实验材料： （1）菌种：葡萄球菌、大肠杆菌斜面培养物。 （2）培养基:普通琼脂平板培养基。 （3）紫外线灯，接种环, 酒精灯等。 实验方法 (1)按无菌操作法用接种环分别从葡萄球菌、大肠杆菌斜面培养物上沾取细菌，反复交叉密涂于平板培养基上(注意不要划破培养基)。注明标记。 (2)打开平皿盖，将小镊子用酒精灯灭菌后，夹取无菌三角形黑纸片，贴琼脂平板中央，并轻轻压紧。放在紫外线灯管下30cm处，直接照射10min。 (3)取下黑纸片， 投入消毒缸内，随即盖上平皿盖，置于37℃培养18～24h观察结果。

实验方法 (1)按无菌操作法用接种环分别从葡萄球菌、大肠杆菌斜面培养物上沾取细菌，反复交叉密涂于平板培养基上(注意不要划破培养基)。注明标记。 (2)打开平皿盖，将小镊子用酒精灯灭菌后，夹取无菌三角形黑纸片，贴琼脂平板中央，并轻轻压紧。放在紫外线灯管下30cm处，直接照射10min。 (3)取下黑纸片， 投入消毒缸内，随即盖上平皿盖，置于37℃培养18～24h观察结果。

自然界细菌的分布 目的：了解细菌在自然界及正常人体的分布，树立严格的无菌操作观念。 1、水中细菌的检查 2、空气中细菌的检查 3、手指细菌的检查 4、口腔中细菌的检查

水中细菌的检查 [材料]高层琼脂培养基 、灭菌平皿、1mL自来水 [方法]采用倾注平板法 ： 1、取1mL自来水置于灭菌平皿中。 2、取1支溶化且已经冷至45℃左右的高层琼脂培养基 倾入平皿中，与自来水混匀后静置待凝。 3、待琼脂冷凝后在平皿底面玻璃上写上标记。 4、置于37 ℃温箱孵育24h观察细菌生长情况及数量。

空气中细菌的检查 [材料]普通琼脂平板 [方法]把普通琼脂平板盖打开，在空气中暴露15min，再盖上平皿盖，置于37 ℃温箱培养24h，观察平板上菌落数及菌落特点。

手指细菌的检查 [材料]普通琼脂平板 [方法]1、用玻璃笔在平皿底部中央画一直线，分为1、2两区。 2、打开平皿盖，用手指直接涂抹于1区。 3、酒精棉球消毒手指后，用手指涂抹于2区。 4、 37 ℃温箱培养24h，观察结果。

口腔中细菌的检查 [材料]血琼脂平板 [方法]打开平皿盖，向血琼脂表面用力咳嗽数次，盖上平皿盖。 37 ℃温箱培养24h，观察结果。

细菌的培养 培养基的制作 培养基的介绍（物理性状、用途） 细菌的培养方法和生长观察 细菌生化反应检查法

常用培养基制备 一、实验目的 (1)掌握基础培养基的制备方法。 (2)了解细菌生长的基本营养条件。 二、实验原理 培养基是用人工方法将多种物质按各类微生物生长需要而制成的一种混合营养物制品。培养基基本成分包括水、氮源、碳源、无机盐等。另外，还需调整适宜微生物生长的酸碱度，并做到无菌。

培养基按物理性状分为固体、半固体和液体培养基三种。按用途分为基础培养基、营养培养基、鉴别培养基及选择培养基。基础培养基中所含的营养物质能满足一般细菌生长所需，在基础培养基的基础上添加一些特殊成分(如糖类、血液、抑制剂等)，则可制成营养培养基、鉴别培养基及选择培养基等。

(一)肉汤培养基 肉汤培养基是常用的液体培养基，也是制备细菌分离培养基和某些其他培养基的基础。 1．实验材料 鲜牛肉500g(去脂肪和肌腱)，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH试纸，碳酸氢钠(质量分数为10％)，醋酸(质量分数为10％)，试管、三角烧瓶、蒸馏水等。

2．实验方法 (1)将鲜牛肉500g切碎或绞碎，加水1 000mL，放4 ℃冰箱过夜。 (2)取出浸泡物倒人容器内煮沸30min，放凉，使残余的脂肪凝固，再用纱布或滤纸过滤，将滤液补足为原量。此溶液称为肉浸液。 (3)1 000mL肉浸液中加入蛋白胨10g,氯化钠5g，加热溶解，放凉。

(4)用精密pH试纸测酸碱度，用质量分数为10％的碳酸氢钠校正pH为7．2左右。 (5)分装于试管或三角烧瓶中，置高压蒸气(103．4 kPa，121 ℃)灭菌器内，20-30min。

如用市售的牛肉膏代替鲜牛肉水时，可将牛肉膏溶成质量分数为0.3％～0.5％的水溶液，再如上法制成培养基。 另外，也可用合成干燥粉末制剂。其方法为：量取18g肉汤干燥粉末，加人1 000ml ,蒸馏水，加热溶解后分装，置高压蒸气(103．4kPa，121 ℃)灭菌器内，20～30min后备用。

(二)普通琼脂培养基 普通琼脂培养基是常用的固体培养基，包括普通琼脂平板和普通琼脂斜面两种，前者用于分离纯种细菌，后者用于增菌或保存菌种。 琼脂是从海藻中提取的一种多糖物质，它对细菌无营养作用，因其特性是100℃溶化，40℃以下凝固，所以将其加入肉汤中溶化后分装，待其凝固后可制成斜面、高层、平板等各种类型的固体培养基。

1.实验材料 肉水 200ml 蛋白胨 2g 氯化钠 1g 琼脂 5g 其他：无菌平皿、灭菌试管、三角烧瓶等

2.实验方法 (1)按上述数量把肉水、蛋白胨、氯化钠、琼脂放到三角烧瓶中，加热溶化。 (2)趁热用pH试纸测酸碱度，用质量分数为10％的碳酸氢钠校正pH为7．2左右。 (3)(103．4kPa，121℃)高压蒸气灭菌20~30min。

(4)趁热将溶化的培养基倒人灭菌平皿内，每个平皿倒入约15mL,，凝固后即成普通琼脂平板培养基；如趁热将培养基倒人灭菌试管内，然后将试管斜放在实验台上，则凝固后即成普通琼脂斜 面培养基。 普通琼脂培养基也可用市售的营养琼脂粉(含有普通琼脂平板培养基的各种成分并已调好pH值)制备，用法见说明书。

新鲜平皿培养基 搁置斜面

(三)肉汤半固体培养基 (1)在上述制备的肉汤培养基中，加人质量分数为0．5％的琼脂，加热溶化，用脱脂棉过滤，补足水分。 (2)用0．1mol／LNaOH调pH至7．6。 (3)分装小试管中(每管约3支)，管口用金属试管帽、棉塞或耐高温的胶塞塞好，置高压蒸气灭菌器内，经103．4kPa，121℃，20～30min灭菌即成。此培养基主要用于观察细菌动力和保存菌种。

(四)血液琼脂培养基 有些细菌其营养要求较高，在普通琼脂培养基上生长不良，可用血液琼脂培养基进行培养。 1．实验材料 普通琼脂培养基 200ml 脱纤维的新鲜羊血或兔血 10 22ml

2.实验方法 (1)加热熔化普通琼脂培养基. (2)待冷至50度左右时,加入无菌的脱纤维血液,混匀(注意勿使产生泡沫). (3)分注于灭菌试管或平皿中，制成血斜面或血平板培养基。

细菌的培养方法和生长观察 细菌的培养方法是将待检临床标本接种于适宜的培养基上进行孵育,获得纯种细菌的方法.它是进一步鉴定细菌,研究细菌的生物学特性、致病性及药物的敏感性,进而指导临床诊断和治疗疾病的基础。

一 、实验目的 (1) 掌握细菌常用的培养方法和无菌操 作技术。 (2) 学会正确观察细菌的生长情况。

二 、实验材料 (1)菌种包括:葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌及乙型溶血性链球菌的斜面培养物。 (2)培养基有:普通琼脂平板培养基,普通琼脂斜面培养基,血液琼脂平板培养基,肉汤培养基,半固体培养基。 (3)接种环,接种针,酒精灯等。

三、实验方法 (一)平板分离培养法 具有较大的表面积,可用于从混杂的检查材料中分离出纯种细菌,其要点是如何获得较多的孤立菌落.常用划线法有连续法和分段划线法.

1.连续划线法 检查材料中含菌量较少时,可用本法.先将接种环用火焰灭菌,待冷却后,挑取检查材料涂于平板的上端,随即向下连续平行划线至平板中部,然后将平板旋转180°,由平板的另一端连续平行划线至平板的中部。划线要密而不重复，充分利用平板的表面。

2．分段划线法 检查材料中含菌量较多时，可用本法以求获得孤立菌落。先将接种环用火焰灭菌，待冷却后，挑取检查材料涂于平板的上端，随即向下连续平行划线于1区。再将接种环用火焰 灭菌，待冷却后划线于2区。同法再划线于3区。可根据菌量的不同，决定分段的数目。

划线完毕，先盖好平板，再将接种环上残留的细菌用火焰灭菌。在平板底面，用记号笔做好记录，送37℃恒温箱中培养，经18-24h，可观察有无孤立菌落生长，每一孤立菌落即为一种纯种细菌。一般病原菌的菌落数少于杂菌，故在分离培养时，应力求出现较多的孤立菌落，以提高病原菌检出率。

注意以下几点： a．培养皿盖尽量紧贴培养皿，以减少空气污染。 b．让接种环在培养基表面滑动。手持接种柄的平衡点（接近中心）处，轻轻拉动。划线时接种环与平板表面所呈的角度要小于(30-40°)，以免划伤琼脂表面。 c．动作要迅速谨慎。不要对着打开的琼脂表面呼吸；尽快盖好培养皿。

划线分离法

平板划线法

(二)斜面培养基接种法 斜面培养基不易污染，常用于培养纯种细菌。斜面培养基通常也采用划线接种法。 实验方法 接种时，右手持接种环，先将接种环灭菌，待冷却后挑取细菌。用手取斜面培养基，用右手小指和小鱼际拇指拔去试管棉塞，将管口通过火焰略微加热灭菌，再将接种环插入试管(勿接触管口）由斜面底部向上划一直线，然后再从斜面底部向上连续平行。 划线完毕，再将试管口通过火焰，棉塞灭菌后，塞好棉塞，最后将接种环灭菌。将接种好的斜面培养基做好标记：放入37℃恒温箱中培养18～24h。

(三)液体培养基接种法 液体培养基接种法可用于增菌，也可通过观察细菌生长情况来鉴别细菌。 实验方法 可采用“双管移植法” 。将琼脂斜面上生长的细菌移种于肉汤培养基中，即左手持细菌斜面培养物和肉汤培养基两支试管，右手持接种环，按无菌操作法取少量细菌，在肉汤表面稍上的管壁上轻轻研磨，使细菌混入培养基内。无菌操作，塞好棉塞，放入37℃恒温箱中培养18～24h。

半固体(高层)培养基接种法主要用于测定细菌有无动力或保存菌种。某些生化反应检查也可用此方法。 (四)半固体(高层)培养基接种法 半固体(高层)培养基接种法主要用于测定细菌有无动力或保存菌种。某些生化反应检查也可用此方法。 实验方法 采用穿刺培养法。将接种针火焰灭菌后，挑取菌落或斜面培养基上的纯种细菌，穿刺于培养基的中心，但不可刺至管底，一般刺入2／3即可。无菌操作，塞好棉塞，放入37 ℃恒温箱中培养18～24h。

四、附录 细菌的其他培养方法 (一)二氧化碳培养法 二氧化碳培养法是将某些细菌(如脑膜炎图2．4奈氏菌、布氏杆菌等)在增加C02的环境中培养的方法。产生C02的方法很多，常用的方法有烛缸法和化学法。

1．烛缸法 将已经接种好的细菌或标本的血琼月抨板置容量约2000mL的磨口标本缸或干燥器内，缸盖及缸口周围涂以凡士林，将点燃的蜡烛直立于缸内(勿靠近缸壁，以免炸缸)，盖好缸盖。缸内燃烛约经0．5-1rain因氧减少而自行熄灭。此时容器内C02的体积分数约为5％-10％，最后连同容器一并置于37~C恒温箱中培养。

2．化学法(重碳酸钠盐酸法) 按每升容积加入重碳酸钠0．4g与浓盐酸0．35mL的比例，分别将两者置于容器(平皿)内，连同容器置于标本缸或干燥器内，盖紧缸盖后倾斜容器，使盐酸与重碳酸钠接触生成C02，以利于细菌生长。

(二)厌氧培养法(Anaerobicculture) 1．厌氧罐法 抽气—换气法。可用带开关的真空干燥缸来做，先用真空泵抽去缸中氧气，使气压降到133．3h(10mmHg)，缸中放有催化剂粒，以催化残余的0》和H2化合成水，造成厌氧环境。缸中还放有美蓝指示剂，如呈厌氧状态，美蓝还原成五色美蓝。检查厌氧程度还可用生物学指标，培养基上接种厌氧菌(如溶血酸菌或坏死梭菌)、需氧菌(如枯草杆菌)，培养后厌氧菌生长而需氧菌不长者为合格。

(2)气袋法 气袋法是用化学方法在塑料袋中造成厌氧环境以培养厌氧菌的方法。气袋是用无毒、透明但不透气的复合塑料薄膜制成，内有化学药品等，以产生一定比例的H2和C02；有钯催化剂管，以催化袋中的02和H2化合成水而去氧；有美蓝指示管，确定袋中是否呈无氧状态。使用时将已接种好的平板装人袋中，用弹簧夹夹紧袋口，使其呈封闭状态。然后将袋内化学药品钯催化剂管折断，

待其化学作用完毕后，再将袋内已还原的美蓝指示管折断，如美蓝不变色即表示袋内已处于无氧状态，即可放人37~C恒温箱中培养。 厌氧袋质量轻，携带方便，不但实验室可用，而且可外出采样和进行床边接种。

2．焦性没食子酸法 取大试管1支，配以大小合适的橡皮塞。将已接种好细菌的试管放人大试管中，并在大试管底部的纱布或脱脂棉上，放焦性没食子酸2g,滴人质量分数为10％的NaOH2mL，使之混合。盖好橡皮塞，用凡士林石蜡混合液密封。置37'C恒温箱中培养2-4d，观察结果。通常lg焦性没食子酸可保证100mL容积内无游离氧存在。

(1)原理。肉渣中含不饱和脂肪酸和氨基酸，有吸氧和还原作用。因降低了培养基的氧化还原电势，所以有利于厌氧菌的生长繁殖。 3．疱肉培养法 (1)原理。肉渣中含不饱和脂肪酸和氨基酸，有吸氧和还原作用。因降低了培养基的氧化还原电势，所以有利于厌氧菌的生长繁殖。 (2)疱肉培养基的制备。 ①将肉汤培养基分装于试管内，每管约10mL，再加入牛肉渣2-3 g； ②每管加已溶化的凡士林2mL； ③103．4kPa，30min高压灭菌。

(3)方法 取疱肉培养基1支，在酒精灯上轻轻加热，使试管内凡土林溶解。再用毛细管将接种材料注入培养基中，直立后凡土林又凝固于疱肉培养基的表面，以防外界氧气进入。置37℃恒温箱中培养2-4d，观察结果。

细菌生化反应检查法 靛基质试验 硫化氢产生试验 尿素分解试验 实验目的 学会常用的细菌生化反应检查方法，理解细菌生化反应检查法在鉴定细菌上的重要意义。 实验内容 糖发酵 靛基质试验 硫化氢产生试验 尿素分解试验

1．糖发酵(Fermentaion of sugars) 目的：了解糖发酵原理及在肠道细菌鉴定中的作用。 原理：各种细菌具有不同的酶，对糖的分解能力也不同，其代谢产物也不一样，有的产酸（如甲酸、乙酸、如酸等），有的细菌尚有甲酸解氢酶，能将甲酸进一步分解产生气体（H2、CO2），可借此区别和鉴定细菌的种类，尤其在肠道细菌的鉴定中经常使用

材料： 菌 种：大肠杆菌（E.coli）、伤寒杆菌琼脂斜面培养物。 培养基：葡萄糖、乳糖发酵管。 流 程： 发酵管→标记→接种→培养→观察→记录 方法： 将细菌接种于糖发酵管中，37℃培养18-24h后 观察结果。必要时可培养更长时间后再判定结 果。

2．靛基质试验(1ndoleproduction) 目的： 检测细菌是否具有色氨酸酶，有无靛基质的产生。 原理：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸而产生靛基质（吲哚）。靛基质无色，如遇靛基质指示剂(对二甲基－氨基苯甲醛)，则于接触面上形成玫瑰红色靛基质。

材料： 菌 种：大肠杆菌（E.coli）、伤寒杆菌琼脂斜面培养物。 培养基：蛋白胨水培养基。 指示剂： 柯氏(kovac)试剂(靛基质试剂） 流 程： 发酵管→标记→接种→培养→观察→记录 方法： 将细菌接种于蛋白胨水中，37℃培养18~24h。

3、硫化氢产生试验(Production of H2S) 原理：有些细菌能分解培养基中的胱氨酸等含硫氨基酸，生成硫化氢。 H2S于培养基中的醋酸铅或硫酸亚铁作用而生成黑褐色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物，视为阳性反应。沉淀物越多，表示生成的H2S量越多。培养基颜色不变，则为阴性。 菌 种：大肠杆菌、乙型副伤寒杆菌、变形杆菌琼脂斜面培养物。 培养基：醋酸铅培养基。 方法： 将细菌穿刺接种于醋酸铅培养基中，37℃培养24h后观察结果。

4、尿素分解试验(Splittmg of urea) 原理：有些细菌具有尿素酶，能分解尿素而产生大量的氨，使培养基呈碱性，而使指示剂酚红变成紫红色。 材料： 菌 种：变形杆菌琼脂斜面培养物。 培养基：尿素培养基。 方法： 将细菌接种于尿素培养基中，37℃培养18～24h。